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【关键词】 表位疫苗；传染性疾病
Advance in the research of epitope vaccine.
LI Jian, YU Chuan-xin.
（Jiangsu Provincial Institute of Parasitic Diseases, Laboratory for Control of Parasitic Disease of MOH,Wuxin 214000, Jiangsu, P. R.China）
疫苗（vaccine）是控制乃至消灭传染性疾病的有效手段。传统疫苗有2种：减毒活疫苗和灭活疫苗。减毒活疫苗虽可刺激机体产生CTL、Th反应，并增强体液免疫等多种保护性反应，但减毒不充分可导致临床感染，减毒过强又可使疫苗效价降低。死疫苗虽然比较安全，但亦有一定的毒副作用。随着分子生物学与分子免疫学的发展，出现了替代减毒活苗与灭活疫苗的基因工程蛋白质疫苗、核酸疫苗及抗体疫苗等新形式的分子疫苗。表位疫苗［1］（Epitope vaccine）则是上述分子疫苗的进一步发展，它是根据抗原表位氨基酸序列制备而成的疫苗，包括合成肽疫苗［2］（synthetic peptide vaccine）、重组表位疫苗［3］（Recombinant epitope-based vaccine）及表位核酸疫苗［4］（Epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes）等形式，是目前研制抗感染性疾病、恶性肿瘤、寄生虫病疫苗的发展方向。与减毒活疫毒苗、灭活苗及其他几种新型的疫苗相比，表位疫苗具有以下特点：首先，表位疫苗安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应，其分子结构小而简单，不会引起自身免疫反应或免疫抑制；其次，表位肽疫苗可对抗原表位进行精确的定位，可对T、B细胞抗原表位进行不同组合，制成针对多种病原体的疫苗；其三，选用微生物中无突变的小片段作合成肽疫苗，可归避病原体因自身快速基因突变所形成的免疫逃避作用，如流感病毒、SARS、HIV等可通过快速而高频的突变逃避宿主免疫系统的攻击。若选择这些病毒分子中无突变的小肽片段作疫苗，就可增强疫苗的免疫保护性作用［5］。本文就表位疫苗设计的理论基础，表位筛选与鉴定，表位疫苗的构建和应用进行综述。
1 疫苗表位的筛选与鉴定
1.1 疫苗表位的筛选 制备表位疫苗的关键是要确定出可被免疫细胞识别的特异性表位多肽序列，因此，表位的筛选是构建表位疫苗的第一步。常用的表位疫苗的筛选方法如下。
1.1.1 化学或生物学方法［10，11］ 化学法是用化学方法蛋白降解成多个不同大小的多肽片断，再利用特异性抗体筛选能与之反应的片断，从而确定该单抗的抗原表位。另一种是水解抗原抗体复合物，这是一个直接的确定线性及构象型B细胞抗原表位的方法。其原理是抗原抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解作用。化学法与水解法确定抗原表位的特异性高，但操作复繁琐，只能获得线性表位。
1.1.2 肽探针扫描技术 肽探针技术的基本原理是应用合成肽技术合成连续重叠的5～7肽，将这些合成肽与相应的抗体反应，分析抗原抗体的结合力，以确定阳性反应片断。这一技术要求明确抗原分子的一级结构，只能检测抗原线性表位。使用肽探针扫描技术筛选抗原表位存在工作量大，耗时长，成本高等缺点，使其应用效果受到限制。
1.1.3 随机肽库技术筛选抗原表位［12，13］ 该方法是利用基因克隆技术将合成的一组多肽的基因寡核苷酸片段混合物克隆至线性噬菌体基因组中，使之以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白的表面，组成噬菌体肽展示库，可展示109以上不同肽序列，几乎包涵了所有的抗原表位序列。从噬菌体随机肽库筛选抗原表位的基本原理是生物淘洗法，先将待测抗体（单抗或多抗）固定在酶标板上，与噬菌体肽库噬菌体结合后，洗脱未结合的噬菌体，收集并扩增与抗体特异结合的噬菌体，再进行下一轮的筛选，如此经过3、4轮的筛选，每次增加筛选强度，就可以获得与抗体特异性结合的单个噬菌体克隆，通过DNA序列分析，确定噬菌体克隆所携带的外源序列，从而得知待测抗体所针对的抗原摸拟表位。噬菌体肽库技术解决了化学和生物法操作繁琐的问题，而且可以同时分析蛋白抗原的线性表位和构象型表位，实现了蛋白质抗原表位从遗传型到表型的转换，是一个有效的抗原表位筛选方法，但其缺点是必须事先制备抗原的特异性性抗体。
1.1.4 人工预测法 对于抗原表位的确定，除了上面提到的研究方法外，为提高抗原表位的鉴定效率，人们根据T细胞抗原表位呈递过程及B细胞抗原表位识别的原理，分别设计出多种T细胞表位，如CTL（MHC I）表位、Th细胞表位（MHC II）及B细胞表位预测方法。 如：T细胞表位预测常用方法有TEPITOPRE软件预测法，人工神经网络（ANN），分子模拟技术等［14～16］； B 细胞预测效果较好的方法［17］主要有6种：二级结构预测（secondary structure），亲水性方案（hydrophilicity），可及性方案（accessibility），抗原性方案（antigenicity），可塑性方案（flexibility）及电荷分布方案（charge distribution）。 预测B细胞抗原表位一般以上述多种方案综合考虑。大量的实验表明，借助于计算机编制的预测软件，能够比较地精确预测T、B细胞表位［18，19］。
1.2 表位的鉴定 由于MHC的多态性及蛋白质本身的结构差异，预测的抗原表位还需要通过实验进一步证实。表位疫苗的鉴定方法可以归纳为以下两类：一是检测受抗原刺激的淋巴细胞增殖情况；二是检测受抗原刺激淋巴细胞分泌的细胞因子情况。
1.2.1 检测淋巴细胞的增殖情况
1.2.1.1 3H标记法 将待检测的表位多肽与免疫小鼠的脾细胞共同孵育，培养一段时间后，在培养基中加入３H标记的胸腺嘧啶，培养结束收集细胞，用液闪仪计数测定cpm。该方法的原理是抗原诱导T细胞活化增殖，细胞的增殖可通过３H－胸腺嘧啶掺入到细胞DNA中的量得到反映。该方法非常敏感，可反映群体细胞的增殖情况，但不能反映单个细胞的增殖情况，使用同位素标记，也不利于操作安全。
1.2.1.2 MTT还原法 细胞群体代谢水平与活细胞总数直接相关，活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲肷,后者可溶于有机溶剂（如二甲基亚砜、酸化异丙醇等）,甲肷产量与细胞活性成正比。通过测量经抗原刺激细胞孔与阴性对照孔中甲肷的颜色差异即可判断细胞增殖情况［20］。此外，还有原理相似的检测淋巴细胞增殖的其它方法。
1.2.2．检测细胞因子的分泌情况
1.2.2.1 ELISPOT试验 酶联免疫斑点试验（ELISPOT）是一种用于检测分泌特异性细胞因子的T淋巴细胞 与B细胞方法，其原理与酶联免吸附试验（ELISA）相似，预先将抗待检测因子的特异性单克隆抗体包被在酶标孔中，淋巴细胞被抗原刺激后如能产生特异性的细胞因子，该细胞则可被固定在酶标板上的抗体所捕获，洗去未结合的细胞，加入酶标记二抗及底物显色，一个细胞形成一个斑点，再通过数码相机扫描与计算机分析来计算斑点数及斑点密度。该方法灵敏度非常高，能从20～30万细胞中检出1个分泌细胞因子的细胞，其敏感性是ELISA的10～100倍［21，22］。
1.2.2.2 胞内流式分析法 是一种有效的在单细胞水平研究细胞因子的方法［23］，通过体外多克隆激活剂, 如佛波酯（PMA ） 和离子霉素（ ionomycin）或特定的抗原激活细胞,产生特异性细胞因子，同时用莫能霉素（monensin,MN）或布雷菲德菌素A brefeldin A, BFA）阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运, 抑制细胞因子释放到细胞外,使产生的细胞因子在细胞质内蓄积, 信号增强。经多聚甲醛固定和皂角苷破膜增加细胞膜的通透性后, 用抗细胞因子的抗体与细胞内特定的分子相结合, 用非相关特异性同型匹配的抗体作为对照, 以确定静止的与无细胞因子分泌的细胞的最小荧光背景, 这样就可用流式细胞仪检测不同细胞亚群分泌的细胞因子。该方法突出的优点是快速简便，不需要长时间的细胞培养，不仅可以确定分泌特定细胞因子的细胞数量，水平，而且可还可以对产生特定细胞因子的表面标志进行鉴定，为研究细胞功能与细胞表面标志之间的关系提供了一个有效的方法［24］。除以上介绍的检测细胞抗原表位的方法外，还有LDH释放法，体外抗原递呈试验等。
2. 表位疫苗的构建方式
由于表位一般只有几个到一二十个氨基酸残基不等，其免疫原性较弱，不能有效地激发细胞免疫或体液免疫，同时容易被蛋白酶降解。为使其有效发挥作用， 就需要对表位疫苗结构进行合理设计，对多肽进行修饰，使用合适的佐剂，改善其免疫原性及稳定性，提高抗原呈递效果，一般采用以下几种方式来构建表位多肽疫苗。
2.1 脂肽疫苗 脂肽疫苗是将具有佐剂活性的脂质分子共价连接于表位多肽链未端，形成稳定的脂肽分子，以脂类分子作为内佐剂。脂肽分子在水溶液表面形成粘滞性单层分子,其脂链迅速与脂膜结合, 以脂质为载体通过跨膜作用或肽抗原识别膜受体作用, 将抗原肽导入细胞内部结构, 进入抗原递呈途径［25,26］，能有效地在体激发抗原特异性体液/细胞免疫反应。常用的脂类分子有三棕榈酰甘基半胱胺酸（P3CSS）、α-氨基十六烷酸及MDP等等。脂肽疫苗的特点是分子稳定，具有亲脂性，能迅速被细胞摄取或形成微胶粒沉淀，不易被血浆、组织中的蛋白酶降解；脂类内佐剂不需要配用其它物质，不会产生毒副作用。
2.2 复合多价表位肽疫苗 复合多价表位肽疫苗是通过人工合成的方法将不同的抗原表位串连起来［27］或是在分枝状的寡赖氨酸架构上连接多个抗原肽形成立体结构的肽丛［28,29］，构建载有多种选定表位肽的复合多价表位肽疫苗。该方法可以有效增强多肽的免疫原性，同时也避免了载体-抗原结构中可能出现的非必需甚至是抑制性表位，具有很大的优越性，其缺点是多肽合成成本高，尤其是立体结构的复合多肽合比较困难。
2.3 微基因核酸疫苗 要发展高效的疫苗，首先是要选定能诱导高水平保护性作用的抗原分子或表位，使之在体内能有效地呈递给免疫淋巴细胞，被淋巴细胞所识别，同时要创造一个有利于疫苗抗原分子诱导保护性免疫反应的内环境，这就要求在疫苗设计过程中要综合考虑这些因素。微基因核酸疫苗［30］是在总结核酸疫苗与多肽疫苗的优点的基础上发展出来的一种新型疫苗，它是通过人工设计的方法采用间隔序列将有效的疫苗抗原表位序列串连在一起，构成一个全新疫苗候选分子基因。微基因核酸疫苗可以在体内表达多个不同的保护性抗原表位使疫苗分子可以从多个方面诱导抗病原体的保护性免疫反应，从而提高疫苗的免疫保护性水平。如果将小基因疫苗分子与诱导免疫反应定向发展的佐剂分子基因及引导新合成蛋白质分子进入细胞内蛋白酶体中的遍在蛋白分子基因进行融合表达，将有利于小基因疫苗分子抗原表位在蛋白酶复合体内获得正确的切割，更易与MHC类分子结合后被呈递给淋巴细胞，诱导定向的保护性免疫反应。微基因疫苗中通常使用一些柔性接头（GPGPG ）［31］或细胞蛋白酶复合体中蛋白酶喜好的氨基酸序列（AAY）［32］作为不同表位之间的间隔序列，使体内合成的微基因疫苗分子中的表位肽段能正确折叠，并在细胞内蛋白酶复合体中能获得正确切割。经酶切降解后的表位肽分子易于与MHC分子的结合MHC肽复合物，促进抗原表位的呈递效果。微基因疫苗因其完全是一种根据人们预防疾病的需要而设计的疫苗分子，具有安全性好，保护性水平高等其它类型疫苗所不具备的优点，因此，在未来的疫苗研究中具有广泛的应用前景。
3 表位疫苗在疾病控制中的应用
3.1 在抗细菌、病毒感染中的应用 目前，多价表位疫苗已经用于多种病毒、细菌防治研究。Nakamura Y等［33］将Listeria菌的抗原表位（ListeriolysinO, LLO）的LLO91插入到反转录病毒载体pMX中，构建表达LLO91表位的核酸疫苗，用其转染小鼠DC细胞，制成LLO处理的DC疫苗。将DC免疫小鼠能诱导强烈的CTL反应及抗Lister细菌感染。Wang等［34］构建了由MPT蛋白M表位（第190-198氨基酸）及P38蛋白的38表位（第166-175氨基酸）组成的两个结核杆菌抗原表位组成的微基因核酸疫苗，并在表位之间用序列AAY连结，连结表位与遍在蛋白（Ubiquitin）融合表达，研究发现M表位与38表位之间使用AAY连结可以促进M表位的呈递，与遍在蛋白融合表达可以增强两个表位的免疫原性，诱导高水平的干扰素产生及特异性CTL反应。HCV高度变异，特别是其E2包膜基因的超变区域，这种变异是发展HCV疫苗的一个主要障碍。Gao J［35］等合成了一个源于HCV的多表位肽抗原微基因（CMEP），并克隆入GST表达载体产生了融合蛋白GST-CMEP。将其与感染HCV病人血清作用发现其活力可达75%。与不同自然HVR1毒株的抗CEMP抗体的交叉活力可达90%。同时，构建HCV DNA疫苗（pVAX1.0-st-CMEP）免疫兔后产生抗体，其交叉活力与GST-CMEP融合蛋白相当, 将成为发展HCV疫苗的一种很有潜力的候选疫苗。
3.2 在抗肿瘤方面的应用 肿瘤抗原的多样性和免疫原性表位发生调变是肿瘤细胞逃避免疫监视的重要机制，多价CTL表位DNA疫苗作为一种新型疫苗，使用相对较小的结构转导多个保守的CTL表位，为人类肿瘤疫苗的设计提供了新的思路。Velders［36］构建了一种包含HPV16抗原中多个HLA-A限制性CTL表位、Th细胞表位和B细胞表位基因信息的DNA疫苗，表位间以间隔子分隔，基因枪法皮下接种小鼠，全部免疫小鼠均耐受致死性肿瘤细胞的攻击；针对肿瘤抗原免疫原性较弱，难以诱发强大免疫反应的特点，采用同尾酶技术构建了β-hCG中第109-118位氨基酸的重复表位微基因疫苗，免疫C57BL/6小鼠可以打破机体对肿瘤的免疫耐受，诱导较强的体液免疫反应，抑瘤率达到了51%，提示微基因疫苗能有效提高肿瘤疫苗的免疫保护作用［6］。
3.3 在抗寄生虫方面的应用 Dat等［7］在对热休克蛋白PfHsp-70的研究中发现此蛋白是抗镰刀状红细胞疟疾的抗原，选取PfHsp-70多个B细胞表位，人工合成表位肽与镰刀状红细胞疟疾感染者的血清反应，发现具有很强的特异性和敏感性；选取抗原性较好的若干个B细胞表位分子，以MAP的形式人工合成复合肽，与疟疾患者血清反应的敏感性和特异性均好于单个表位分子。Birkett［8］将多种环子孢子蛋白的B细胞表位和T细胞表位与乙肝病毒表面抗原或核心抗原串联重组后免疫人体，可激发机体产生高水平的抗体和Th1型细胞免疫应答，而且以合适的佐剂免疫人体后对恶性疟原虫攻击感染产生了50%的保护力。曼氏血吸虫Sm32分子是抗血吸虫疫苗的候选分子之一，Chacon等［9］预测了曼氏血吸虫Sm32分子的T、B细胞表位，人工合成这些表位，分别经皮下注射入C57BL/6小鼠，取免疫后的小鼠血清与曼氏血吸虫成虫抗原反应，这些血清能被血吸虫成虫抗原识别；将敏感性较强的B细胞表位按随机顺序连接起来，人工合成复合表位肽免疫小鼠后发现，Sm32分子位于101～120、224～273、292～313位氨基酸区域的3个表位中无论是单个还是复合表位肽的敏感性和特异性都很强。复合表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答要强于单个表位肽诱导的免疫应答。
4. 结语
随着“表位生物学”概念的提出，许多蛋白抗原的表位相继得到鉴定，表位疫苗愈来愈受到人们广泛的重视，并呈现极大的发展空间。与常规DNA 疫苗相比具有更多的优势，其特点是具有安全性好、容易获得、特异性强，可以在同一载体中表达抗同一病原的多种抗原表位，诱导多重免疫保护性反应，或在同一载体中表达抗多种病原的抗原表位，避免了将多个抗原基因同时克隆到同一载体的困难，以及可能由此引起的转录干扰问题，使研制预防多种疾病的广谱疫苗成为可能。虽然表位疫苗具有许多其它疫苗无法比拟的优点，但需要在如下几个方面进一步改进：（1）表位多肽分子小、免疫原性较弱，需要进一步发展增强表位多肽免疫原性，促进抗原表位呈递的新的免疫策略与方法；（2）多价表位疫苗，可以诱导多重免疫保护性反应，但是如何使疫苗中不同的表位诱导的免疫保护性反应发生协调作用，提高疫苗的整体免疫保护性水平，需要在疫苗构建的策略上作更做更深入细致的探讨。随着分子免疫学研究水平的不断提高，表位疫苗的研究与应用必定会有非常广泛的应用前景。
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作者单位：卫生部寄生虫病防治控制技术重点实验室，江苏寄生虫病防治研究所，江苏 无锡 214000.