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【摘要】 目的 观察亚甲蓝（MB）对静脉普鲁卡因复合麻醉（IPA）期间患者体内过氧亚硝酸阴离子（ONOO-）的清除作用。 方法 40例择期手术患者，根据麻醉方法不同随机分为对照组［芬太尼（F）组］和观察组［IPA（P）组］。分别观察麻醉诱导前（T0）、麻醉120min（T1）、180min（T2）及静脉注射MB（1～2mg·kg-1） 后30min（T3）患者血内一氧化氮（NO）、氧自由基（OFR）、脂质过氧化物（LPO）、高铁血红蛋白（MHb）含量，红细胞超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、还原型辅酶I-细胞色素b5还原酶（NADH-cyt b5-R）活性、IPA期间血浆普鲁卡因及对氨基苯甲酸（PABA）浓度变化。 结果 P组T1、T2与T0相比NO、OFR、LPO、MHb均有显著升高（P<0.05或0.01），SOD、CAT、NADH-cyt b5-R均有显著降低（P<0.05或0.01）。T3时NO等7项指标均恢复至正常水平（P<0.01）。以MHb为因变量（Y）与其他8项自变量的多因素逐步回归分析显示,对MHb有显著影响的指标依次是：T1：PABA、OFR、NADH-cyt b5-R；T2：OFR、NADH-cyt b5-R。F组T0～T3诸指标无显著改变。 结论 临床治疗剂量的MB在人体内具有直接清除ONOO-的特性。
【关键词】 亚甲蓝；普鲁卡因；亚硝酸盐类；高铁血红蛋白；氧化还原酶类
Effect of methylene blue in clearance of peroxynitrite anion in vivo.
LIANG Min, WU Duo-zhi.
（Hainan Provincial People’s Hospital , Haikou 570311, Hainan, P.R. China）
Abstract：Objective To investigate the effect of methylene blue（MB） in eliminating peroxynitrite （ONOO-） in vivo during intravenous procaine anesthesia （IPA）. Methods Forty patients receiving selective surgery under procaine anesthesia were randomized divided into fentanyl anesthesia group consisted of patients as control and observation group consisted 20 patients. Peripheral venous blood samples were taken before induction（T0）,120min （T1） and 180（T2） min after anesthesia and 30 min after treatment with MB（1～2mg·kg-1,T3 ） and the levels of nitric oxide （NO）, oxygen free radical （OFR）, lipid peroxide （LPO）, superoxide dismutase （SOD）, catalase （CAT） NADH-cyt b5-reductase （NADH-cyt b5-R）, methemoglobine （MHb） and the plasma levels of procaine and p-aminobenzoic acid （PABA） were determined during IPA. Results The levels of NO, OFR, LPO and MHb at T1 and T2 （P<0.05 or 0.01） were significantly increased in observation group, the levels of SOD, CAT and NADH-cyt b5-R were significantly decreased, the levels of NO, OFR, MHb, SOD, CAT and NADH-cyt b5-R were all reduced to the normal at T3 （P<0.05 or 0.01）. The results of multivariate gradually regression analysis showed that PABA（X8）, OFR（X5）, NADH-cyt b5-R（X2） do remarkably influence the level of MHb（Y） at T1 and X5, X2 at T2 （P<0.01）, but not in the control group. Conclusion MBt is capable of directly eliminating ONOO- in vivo with the doses of clinical treatment.
Key words：Methylene blue; Procaine; Nitrites; Methemoglobine； Oxidoreductases
近年的研究表明一氧化氮（NO）与超氧阴离子（Superoxide anion O2-）的反应产物过氧亚硝酸阴离子（Peroxynitrite,ONOO-）是一种强效细胞毒性物质［1］。迄今尚未发现体内有清除ONOO-的特异性酶。体外实验发现亚甲蓝（MB）可清除ONOO-［2］，但未得到临床证实。本研究旨在通过观察MB对静脉普鲁卡因复合麻醉（IPA）期间患者体内过量产生的高铁血红蛋白（MHb）、NO、氧自由基（OFR）及抗氧化酶活性的影响，从分子水平探讨临床治疗剂量的MB对人体内ONOO-清除剂特性，为危重病治疗中抗氧化剂的应用提供依据。
1 资料与方法
1．1 一般资料 选择40例ASA Ⅰ～Ⅱ级择期手术病人（颅脑手术除外），男19例，女21例，年龄17～76岁，平均（48±16）岁。术前无遗传性疾病。随机分为观察组即IPA（P）组（n=20）和对照组即芬太尼（F）组（n=20）。
1．2 麻醉方法 麻醉诱导依次用静注氟哌利多0.1mg·kg-1、芬太尼1.5～2μg·kg-1、依托咪酯0.3mg·kg-1、潘库溴铵0.05～0.1mg·kg-1行气管插管后控制呼吸。麻醉维持P组以2%普鲁卡因250ml、哌替啶50mg、维库溴铵4mg复合液静脉滴注普鲁卡因平均滴速T1为（1.05±0.4mg·kg-1min-1）。F组静注芬太尼10μg·kg-1、维库溴铵0.05～0.1mg·kg-1，1h后追加半量。两组均辅以1%～2%的异氟醚吸入。
1．3 血样采集和测定 分别于麻醉诱导前（T0）、麻醉120min（T1）、180min（T2）,静注MB（1～2mg·kg-1） 后30min（T3）经外周静脉采取血样5ml，立即以3 000r/min离心后，分离血浆（清）及血红细胞置-20℃冰箱保存待测。MHb在30min内测定完毕。NO采用硝酸还原酶法。OFR采用电子自旋共振（ESR）方法。脂质过氧化物（LPO）采用硫代巴比妥酸法。红细胞超氧化物歧化酶（SOD）采用肾上腺素法。过氧化氢酶（CAT）采用紫外速率直接法。还原型辅酶I-细胞色素b5还原酶（NADH-cyt b5-R）活力：采用朱氏改良的Hegesh方法。MHb（%）含量采用Brown比色法。血浆普鲁卡因浓度采用高压液相色谱法，最小检测灵敏度为0.3μg/ml。血浆对氨基苯甲酸（PABA）浓度采用改良的Ting比色法。
1．4 统计学分析 所有数据均以（x±s）表示组内、组间比较配对t检验应用SPSS 10.0统计软件处理P<0.05为差异有统计学意义。为筛选IPA期间影响MHb血症的因素，P组以MHb为因变量（Y），以其他8项指标为自变量行多元逐步回归分析。按每个自变量作用，由大到小依次引入回归方程进行偏回归系数与常数项的显著性检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
麻醉前两组诸指标间差异无显著性。P组T1、T2与T0相比NO、OFR、LPO、MHb均有显著升高（P<0.05或0.01），SOD、CAT、NADH-cyt b5-R均有显著降低（P<0.05或0.01）。T3时NO等7项指标均恢复至正常水平（P<0.01）；F组T0～T3诸指标无显著改变（P>0.05）。诸指标组间比较（T1、T2）差异有显著性（P<0.01），见表1。
表1 两组麻醉期间诸指标的含量变化（略）
P组T0与T1、T2、T3比较，ΔP<0.05， P<0.01； F组与P组间相应时间点比较，#P<0.05，△△P<0.01。
*单位定义：每mg样品Hb每分钟使1μmol/L的MHb被还原为1单位（U）
IPA期间MHb与NADH-cytb5-R；NO与OFR；SOD与OFR、LOP、普鲁卡因血药浓度自始至终保持显著的相关关系。见表2。
表2 IPA期间诸指标间的相关关系（略）
P组以Y代表因变量（MHb），以X1=LPO、X2=NADH-cyt b5-R、X3=SOD、X4=CAT、X5=OFR、X6=NO、X7=普鲁卡因、X8=PABA代表自变量。按每个自变量作用大小依次引入回归方程进行显著性检验结果显示： 对MHb 有显著影响的指标依次是T1：PABA、OFR、NADH-cytb5-R； T2：OFR、NADH-cytb5-R，其中以OFR回归效果为显著（P<0.01），见表3。
表3 IPA期间MHb与其他因变量的逐步回归分析结果（略）
注：a=0.10,X8=PABA,X5=OFR,X2=NADH-Cytb5-R
3 讨论
IPA期间普鲁卡因在体内被血浆胆碱酯酶水解为PABA和二乙氨基乙醇（DEAE）。前者经脱竣形成苯胺,其在肝脏微粒体细胞色素P-450.的N-羟基化作用下,形成了对Hb具有强氧化作用的N-羟氨基苯,导致MHb和O2-的大量生成［3］。DEAE经代谢形成二乙胺为亲核NO供体,在体内可自发释放NO［4］。NO与O2的快速反应产生ONOO-比O2- 与SOD的反应速率快3倍,ONOO-能与MHb作用生成球蛋白结合的自由基种并诱导脂质过氧化作用［5］, 使SOD活性中心上的酪氨酸残基亚硝化［6］。NO与 CAT、Cytb5活性中心上的铁结合而可逆性的抑制酶 活性［7］。本研究结果发现IPA期间NO与OFR,SOD与OFR、LPO、普鲁卡因血药浓度间呈显的相关关系,其中OFR与MHb线性回归效果最为显著。证实了IPA期间ONOO-大量生成介导了RBC的过氧化损伤。MB是一种氧化还原剂,近年来研究证实MB尚具有抑制诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达及功能［8］、抑制内毒素导致的肿瘤坏死因子合成［9］、抑制OFR形成、减少花生四烯酸代谢等作用［10,11］。在危重病治疗中显示了良好效果。Dotsch等［12］通过体外实验计算了MB治疗剂量与测定的MHb浓度间的量效关系时发现1 可抑制（1.90土0.10）%（P<0.01）的MHb形成。本研究用ESR技术证实MB（1～2mg·kg-1 iv）能明显提高体内RBC抗氧化酶活力、显著降低血内NO、OFR、MHb水平。在人体内具有直接清除ONOO-特性。其机制可能是:（1） MB在人体内充当NADH-MetHb的电子载体,明显提高患者SOD、CAT、NADH-MetHb还原酶活力。⑵MB从黄嘌呤氧化酶（XO）上与分子氧竞争转移电子从而抑制了O2-的产生［13］。（3）MB能将细胞内鸟氨酸环化酶（sGC）中Fe2+氧化为Fe3+而抑制NOS的表达,降低NO的生成［14］。 （4）MB通过氧化对sGC活化起关键作用的亚铁血红蛋白和/（或）疏醇, 选择性抑制sGC［9］拮抗了NO,抑制ONOO-的过量产生。
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作者单位：海南省自然科学基金资助项目（No:2000-80010） 海南省卫生厅2002年度重点科研资助（2002-55） 海南省人民医院麻醉科，海南 海口 570311.