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【摘要】 目的 比较双向电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离人血清中蛋白质的效果。 方法 双向电泳直接分离人血清中的蛋白质;采用改进后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离去除白蛋白的人血清样品。 结果 双向电泳图谱显示，样品在分子量为10 k～20kDa可以分离出较清晰的蛋白质点，但在8 000 Da以下没有分离出清晰的蛋白质点，且在20kDa以上的蛋白质点，凝胶背景模糊不清。而采用改进后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示，可有效分离10kDa以下的小分子蛋白质。 结论 两种电泳技术各有所长，需根据目的蛋白的特点选择适合的方法。
【关键词】 蛋白质；分离；双向电泳；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Comparative study on separating of protein in human serum with two electrophoretic techniques.
WEI Xiao, ZHANG Zhi-yong, HE Min, et al.
（Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention, Nanning 530021, Guangxi, P. R.China）
Abstract：Objective To compare the effect of separating protein in human serum with two-dimentional electrophoresis （2-DE） and SDS-PAGE. Methods 2-DE was used to separate the protein in human serum directly, and the modified SDS-PAGE was used to separate the human serum sample in whicht albumin was removed. Results The image of 2-DE showed that protein spots from 10 kDa to 20 kDa were separated clearly, but protein spots less than 8 000 Da were not effectively separated. The gel background of protein spots above 20 kDa was obscure. The image of the modified SDS-PAGE showed that small molecular proteins of less than 10 kDa were effectively separated. Conclusion The advantages of two electrophoretic technologies varies and they can selected according to actual features in separating target proteins.
Key words：Protein; Separation; Two-dimentional electrophoresis; SDS-PAGE
双向电泳（Two-dimentionlal gel electrophoresis,2-DE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）都是蛋白质组学研究的经典方法，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。近年，在疾病（尤其是肿瘤）的血清蛋白质组学研究中，运用2-DE和SDS-PAGE已成功地从人血清中分离鉴定出一些特异的血清蛋白标记物［1,2］，为疾病的早期诊断及治疗奠定了基础。但是由于两种电泳方法在分离原理上的差异，使它们在分离纯化蛋白质的分子量大小、特性和丰度等方面各有不同［3～6］。作者分别用两种电泳方法分离纯化人血清中的标志蛋白，并对它们的分离效果进行比较。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 丙烯酰铵、N，N＇-甲叉双丙烯酰铵、过硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三羟甲基甲基甘氨酸（Tricine）、尿素（Urea）、二硫苏糖醇（DTT）、3-［（3-胆酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸（CHAPS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、低分子量蛋白质标准品等试剂（均为上海生工生物工程有限责任公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）（美国GibcoBRL公司）；两性电解质（美国Bio-Rad公司）；苯甲基磺酰氟化物（PMSF）（深圳赛泰克生物科技有限公司）；碘乙酰胺（IAM）（美国Promega公司）；IPG缓冲液（pH3～10NL）、固相pH梯度胶条（pH3～10NL，7cm）、固相pH梯度干胶条覆盖液（瑞典Amersham Pharmacia公司）；IPG-Phor等电聚焦仪、ETTAN Ⅱ型垂直板电泳仪（瑞典Amersham Pharmacia公司）；Power Pac HCTW电泳仪、Mini Protean 3well垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司）；ZP-200型脱色摇床（江苏太仓市实验设备厂）。
1.1.2 样本 样品选自广西医科大学第一附属医院经病理诊断的肝细胞癌患者血清。
1.2 方法
1.2.1 双向电泳 （1）样品的制备：将血清样品（50μg/μl）与裂解液（40mmol/L Tris-HCl，pH8.5），8 mol Urea，4%CHAPS，0.5%两性电解质）混合，置冰上30min。再加入PMSF、EDTA和IPG缓冲液，使PMSF和EDTA的终浓度分别为2mmol和1mmol。将固相pH梯度胶条（pH 3～10NL，7cm）置于泡涨液（8mol Urea，2%CHAPS，微量溴酚蓝）中，并加入处理好的样品，浸泡12h。（2）电泳：将400μl固相pH梯度干胶条覆盖液加在处理好的胶条上，根据 IPG-Phor指导手册的说明进行等电聚焦。一向聚焦55kVh后，1%DTT和2.5% IAM先后分别平衡胶条15min。转入12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，先10mA约1h，再20～30mA至结束。（3）染色：电泳结束后，银染采用双向电泳手册方法进行。（4）图像分析：对染色后凝胶进行扫描，用ImageMaster5.0 2D PLATINUM进行图像分析。
1.2.2 SDS-PAGE单向电泳 （1）溶液配制： A贮液为49.5%T，3%C；B贮液为49.5%T，6%C。胶缓冲液为3mol Tris， 0.3g/L SDS用HCl调pH值至8.45。阳极缓冲液为0.2mol Tris，用HCl调pH值至8.9；阴极缓冲液为0.1mol Tris，0.1mol Tricine，0.3g/L SDS用HCl调pH值至8.25。样品缓冲液为3mol Tris （pH 8.45），2.4ml甘油，0.8g SDS，0.3mol DTT, 少许溴酚蓝，定容至10ml。（2）胶的制备：按文献［7］分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶。（3）样品处理：去除血清白蛋白后的样品与2倍体积U9缓冲液（9mol Urea, 2% CHAPS, 1% DTT）混匀，400～600r/min冰浴振荡30min变性。取变性后样品与样品缓冲液等体积混匀，60℃水浴加热5min。（4）电泳：内槽装阴极缓冲液，外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40V约1.5h，当样品进入分离胶时，电压升至60V约1.5h。（5）染色和脱色：电泳结束时，用双蒸水把胶面洗净。置于染色液（0.1%甲醇, 0.5%三氯乙酸, 0.1%考马斯亮蓝G250）中，50～60r/min，振荡染色1h。然后用双蒸水洗净胶面，转至双蒸水脱色，1h。更换双蒸水2～3次，直到背景清晰。
2 结果
2.1 血清样品双向电泳图谱 血清样品经双向电泳分离后，凝胶结果显示，样品在分子量为10 k～20kDa可以分离出较清晰的蛋白质点，但在8 000 Da以下没有分离出清晰的蛋白质点。且在20kDa以上的蛋白质点，凝胶背景模糊，高丰度蛋白（如白蛋白，IgG等）污染严重，蛋白质点分辨不清。
2.2 血清样品SDS-PAGE单向电泳图谱 去除血清白蛋白后的样品经SDS-PAGE单向电泳分离后，凝胶结果显示，凝胶背景颜色浅，白蛋白污染显著减少，电泳可分离出10kDa以下的小分子蛋白质（见图1）。
图1 电泳凝胶图（略）
A：低分子量蛋白质标准品； B：样品。
3 讨论
双向电泳是蛋白质分离纯化的主流技术，它能将组织和细胞中成千上万种蛋白高分辨、高灵敏的分离以满足随后的质谱分析［1,8］。本实验的双向电泳图谱结果也显示，样品在分子量为10 k～20kDa可以分离出较清晰的蛋白质点。但2-DE技术仍然存在许多局限性：疏水性蛋白、低丰度蛋白、分子量极大或极小和极酸性或极碱性蛋白，2-DE都很难检测；上样量的限制也使低丰度蛋白质难以检测等等［3～5］。同时本实验的双向电泳图谱结果也发现，在分子量为8kDa以下基本没有分离出清晰的蛋白质点，且凝胶背景模糊不清。考虑除了2-DE本身的局限性外，样品的制备也是影响2-DE结果的主要因素［9］。人血清中的一些高丰度蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白等）占血清总蛋白的80% 以上，这些高丰度蛋白不仅会掩盖许多重要的低丰度蛋白，而且还会相对减少低丰度蛋白的上样量。因此，去除血清中的高丰度蛋白是首要关键。Ahmed等［10］去除人血清中的白蛋白和免疫球蛋白后，在2-DE上显示的蛋白质斑点数目和丰度都明显增加。与双向电泳相比，虽然传统的单向电泳技术最多只能分离约100种蛋白，且由于一些蛋白和目的蛋白具有相近的等电点或分子量，无法得到完全分离，但仍具有操作简便、重现性好和经济等特点。近几年发展起来的Tricine-SDS-PAGE单向电泳技术，还可以有效地分离小至1kDa的小分子蛋白或多肽［6］。本实验应用的SDS-PAGE单向电泳技术在样品制备、染色等方面进行改进后［2］，可分离出10kDa以下的小分子蛋白质，为下一步从凝胶中回收目的蛋白，并用质谱鉴定提供了条件。总之，两种电泳技术分离纯化蛋白质各具所长，需根据目的蛋白的特点选择，才能达到分离目的蛋白的目标。
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作者单位：广西科学基金项目（桂科攻0322025-2；桂科攻0428005-12） 广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西 南宁 530028; 广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁 530021; 广西医科大学医学科学实验中心，广西 南宁 530021.