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【摘要】 目的 使用Y染色体单核苷酸多态性（Y-SNP）的证据从遗传学角度研究中国黎族的起源。 方法 选取部分与人类迁移相关的Y染色体非重组区的单核苷酸多态位点，采用PCR-RPLF和geno-typing法分析这些单核苷酸多态位点的多态性，观察由这些多态性位点组成的单倍型在黎族五个支系人群中的分布情况，并将结果与其他人群的分布进行比较。 结果 在黎族人群中发现4种Y染色体单倍型，其中单倍型O*-175为五支系所共有，且分布频率都在95%以上，其它3个单倍型只在部分支系中很少量存在。 结论 黎族五个支系可能有共同的起源，起源于中国古代百越的可能性最大，并与台湾原住民关系非常接近。
【关键词】 黎族起源；Y染色体；单核苷酸多态性；单倍型
Investigation into the origin of Li ethnic group in China by genetic analysis of Y chromosome single nucleotide polymorphism.
SUN Yuan-tian, YANG Bo, OU Cai-ying, et al.
（Department of Microbiology of Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan, P. R. China）
Abstract：Objective To investiagte the origin of Li ethnic group in China by genetic analysis of Y-SNP. Methods Oligo nucleotide polymorphic sites on the noncombinatant part of Y chromosome associated with human migratinggenes were selected and the polymorphisms of the oligonucleotide on polynorphic sites were anlayzed by using CR-RPLF and geno-typing. The distribution of haplotype consisted of these polimorphic sites in the branches of five Li ethnic group was observed and the results were compared with other population. （6 biallelic markers located the nonrecombining portion of the Y chromosome in 335 males from 5 branches of Li ethnic groups, analysis the frequencies of Y-chromosome haplotype compared with several other East-Asia populations）. Results Four haplotypes were found in Li ethnic group in China, the O*-M175 haplogroup was common and predominant in all branch groups, the other three were diversified. Conclusion The five branches of Li ethnic groups might be origined from the same ancestor and they might origined ancent Baiyue and are closely related with Malayan in Taiwan.
Key words：Origin of Li ethnic group； Y-chromosome； SNP; Haplotype
海南岛地处中国最南端，由琼州海峡和北部湾将其与中国大陆和中南半岛隔离。在地质学的最后一次冰川时期—大理冰期（7～1.2万年前），由于海平面的下降，她与大陆连在一起［1］。在这一时期，这一区域正是东亚人群形成的关键区域，中国的百越和古马来族的形成都与这一区域相关［2］。因此，作为海南岛最早居民的黎族，其起源早已引起人们的关注。然而从20世纪30年代开始，至今已达半个多世纪，但人们对它仍没有一致的结论。关于黎族的起源现今有多种学说［3～5］。主流观点是黎族起源于百越的一支—骆越，这一学说受到考古、语言和民情风俗等方面的证据支持。此外，何光岳认为黎族源出于皇帝族，受商王朝的征讨而南迁至海南岛形成黎族；H.Stubel等则认为东南亚的一些古老民族移民至海南形成黎族，现今黎族的5个支系是他们多次移民浪潮的结果；最后在东南亚分布颇广的“黑矮人”以及黎族关于“族栈”的故事传说似乎给还给黎族的起源带来另一种可能性：“黑矮人”可能参与了黎族的组成。三亚市落笔洞遗址的考古发掘已将海南岛人类活动历史追溯至1万年前［6］，而2006年在昌化江发现的旧石器时代遗址可能再次将海南岛人类活动历史提前至2万年前。本文将从人类群体遗传学角度对黎族的起源展开研究。通过研究黎族人群中由Y染色体单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）组成的单倍型的分布，分析中国黎族的父系起源及其与其他民族的亲缘关系。
1 材料与方法
1.1 样本采集 根据知情同意的原则，在海南省内5个不同支系的黎族聚集地区随机采取335名黎族正常男性外周血标本。本地（润）黎人群取自海南省白沙黎族自治县、加茂黎人群取自保亭黎族苗族自治县、亻孝黎人群取自乐东黎族自治县、美孚黎人群取自东方市、杞黎人群取自五指山市。所选对象彼此无亲缘关系，3代内无与其他民族或支系通婚史。
1.2 DNA样本制备 常规酚-氯仿法提取外周血淋巴细胞DNA，测定OD 260/208比值，并标准化DNA浓度至25mg/L。
1.3 Y染色体单倍型的基因分型 依据由YCC（The Y Chromosome Consortium，http://ycc.biosci.arizona.edu/）的人类Y染色体双等位基因单倍型进化树，我们选取了与东亚、东南亚人群相关的6个Y-SNP位点进行基因分型，分别是M130、M89、YAP、M9、M175、M45。其中M175位点的分型采用geno-tying法，PCR扩增后由全自动荧光测序仪ABI3130自动分型；其它位点采用PCR-RFLP法，经两步PCR（Long-PCR、Nest-PCR）扩增后，产物用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳检测结果。引物由上海生工生物工程公司合成，限制性内切酶由购自Biolab公司。
2 结果
2.1 Y染色体SNPs基因分型 对黎族五个支系的基因分型，共得到4种单倍型。表1中列出了这五个支系Y染色体单倍型的分布频率，以及已报道的东亚其它相关人群的分布频率。
2.2 单倍型的统计学分析 对所得单倍型数据进行聚类分析和主成份分析，所得结果见图2和图3。
图1 Y染色体分型标准（略）
Fig 1 The typing standard of Y chromosome haplotype
表1 黎族各支系及相关民族人群Y染色体单倍型频率分布（略）
Tab 1 Y-chromosome haplotype frequency distribution in Li and some concerned populations
注：表中黎族人群中的频率分布数据为本文实验结果，其余数据引自参考文献［2］。
图2 各人群Y染色体单倍型频率主成分分析图（略）
Fig 2 Principle component map of all populations concerned the first three components in this map account for 86.4% of genetic variation
图3 各人群Y染色体单倍型频率聚类分析图（略）
Fig 3 Hierarchical cluster analysis of all concerned populations
3 讨论
人类Y染色体长约60Mb，除了2.6kb的两臂末端拟常染色体区（Pseudoatosomal region，PAR），其余区域由于在减数分裂中不发生重组，被称为Y染色体非重组区域（The nonrecombining portion of Y chromosome，NRY），因而位于NRY的DNA序列呈现严格的单向父系遗传模式，同时它还具有有效群体小、突变率极低（每代突变率约在10-8水平）、几乎没有回复突变等优点,因而对它所包含的SNP位点的研究被认为是研究早期人类起源和迁移的最理想的工具［7～9］。2002年，YCC根据世界范围内各人群的Y-SNP研究资料，总结出一个根部位于非洲的Y染色体双等位基因系统进化树。其中M168是非洲以外的所有人群所共有的突变位点，M168下游又分化出M130、M89、YAP三个分支［11］。柯越海等［10］对中国范围内包括9个少数民族在内的近1万份样品的研究结果表明，所有个体都属于M130、M89、YAP三个分支之一，由此从Y染色体遗传学角度得出中国人群起源于非洲的结论，随后中国其他少数民族及东亚其它国家人群的研究结果也显示东亚人群的非洲起源［11］。本研究结果中，黎族五个支系都带有M130或M89多态位点，因而黎族人群与东亚其它人群有同一非洲起源。在东亚广泛出现的黑矮人又称“尼格利陀人”（Negrito），Negrito都带有一种古老的Y-SNP-YAP，都同属于单倍型D-YAP，安达曼群岛的安达曼人、马来半岛中部的塞芒人（Semang）和菲律宾群岛的阿埃塔人（Aeta）都属于这一类型,并且在东亚其他人群中也都有不同频率的出现［12］。但D-YAP单倍型并没有在黎族中出现，因而“黑矮人”并没有参与黎族的组成。聚类分析和主成分分析的结果显示，黎族与汉族、苗族、瑶族的遗传关系较远，不支持黎族的皇帝族起源学说。但并不能把黎族与马来族人和起源于骆越的壮族、布依族、水族、侗族的遗传关系分开，因而无法对百越起源和东南亚起源进行判断。这是因为他们都含有很高比率的O*-175单倍型的缘故，马来族本身就有起源于中国的东南沿海的可能。O*-175单倍型人群都带有一个共同的Y-SNP位点—M175，具有很强的东亚特异性。要区分百越起源和东南亚起源还需要对O*-175单倍型的下游分支进行更详细的遗传学研究。从黎族的Y-SNP单倍型结果中我们还可以看出，黎族五个支系有95%以上都属于同一个单倍型O*-175，这一比率远高于其他人群，因而黎族支系间的亲缘关系非常接近，他们有共同起源毋庸置疑。这一点在聚类分析和主成分分析结果中也有体现。同时，我们还发现，代表台湾原住民的阿美族、排湾族人群属于O*-175单倍型的比率占100%，这提示，黎族与台湾原住民的起源很亲近，这一点与他们文化、体质的相似以及考古学证据能够相互印证。结合在海南和台湾都发现有一万年前的旧石器和新石器遗址，而O*-175单倍型出现的年代也约在3万5千年前。因而有一个可能的解释就是,在最后一次的冰川时期，海南和台湾与大陆相连，O*-175单倍型人群曾遍布于整个海南-台湾这一连续的区域，黎族和台湾原住民的祖先在一万年前就已经分别到达海南和台湾，随着1万年前的冰川期结束，海平面上升使海南和台湾与大陆分离。随后大陆的人群与其他人群互相融合，形成后来的百越，而由于地理的隔阂，黎族和台湾原住民依旧保持非常纯的O*-175单倍型。要确定这一点就需要对黎族形成的具体时间进行研究，因而还需要对Y染色体短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）多态性进行研究。
【参考文献】
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［12］ Altheide TK，Hammer MF．Evidence for a possible Asian origin of YAP+ Y chromosomes［J］．Am J Hum Genet，1997，61（2）：462～466.
作者单位：国家自然科学基金（30460056） 海南医学院生物教研室，海南 海口 571101； 第三军医大学解剖教研室，重庆 400038.