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【摘要】 目的 探讨人类白细胞抗原DRw53（HLA-DRw53）基因在变应性血管炎患者治疗前后mRNA表达量的变化。 方法 采用低渗盐析法从外周血中分离白细胞，Trizol试剂提取白细胞总RNA，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其完整性和浓度。利用随机引物逆转录合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），根据HLA-DRw53基因第二外显子序列和管家基因人磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的cDNA序列设计序列特异性引物。检测43例变应性血管炎患者治疗前后与24名正常人HLA-DRw53基因mRNA表达量的变化。 结果 治疗前组HLA-DRw53基因mRNA表达与正常对照组和治愈组比较差异有统计意义（P＜0.01）；治愈组表达量与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 HLA-DRw53基因与变应性血管炎之间存在相关性，且可能在抗原呈递中起作用，这对指导变应性血管炎的病因研究以及治疗方向有一定的意义。
【关键词】 人类白细胞抗原DRw53；变应性血管炎；相关性
Expression of mRNA of HLA-DRw53 gene in allergic vasculitis patients before and after treatment.
WANG Zhong, LIAO Zu-yuan, LIU Lian-qing, et al.
（Meizhou Municipal Chornic Disease Hospital, Meizhou 514021, Guangdong, P. R. China）
Abstract：Objective To observed the variations of quantity of human leucocyte antigen DRw53 gene （HLA-DRw53） expressed in allergic vasculaitis patients before and after treatment. Methods The total RNA of leucocyte was extracted 43 allergic vasculitis patients and 24 normal subjects before and after treatment with Trizol reagent and the integrity and concentrations of HLA-DRw53 gene mRNA were determined by agarose gel electrophoresis and UV spectrophotometer after denatured with 1% formaldehyde, the product was transcribed into complementary retroviral synthetic deoxyribonucleic acid （cDNA）, and sequence-specific primers were designed based on the sequences of second HLA-DRw53 gene exon and housekeeping gene glyceraldehyde phosphate-dehydrogenase （GAPDH ） cDNA. Results The expression of HLA-DRw53 gene mRNA in the pretreatmetn group was significantly different as compared with that of the normal control group and cure group （P<0.01）; There no significant differences were observed in the expression of HLA-DRw53 gene mRNA between the cured group and the normal control group （P>0.05）. Conclusion There is correlation between the expression of HLA-DRw53 gene and allergic vasculitis.
Key words：HLA-DRw53; Allergic cutaneous vasculitis; Correlation
研究表明人类白细胞抗原（HLA）复合体参与人免疫反应的多个环节，其中HLA-Ⅱ类抗原（HLA-DR）在调节免疫反应中起关键性作用［1］。变应性血管炎是比较常见的一种疾病，其组织病理有白细胞核破碎的血管炎表现，有皮肤损伤，也有多个内脏损伤。现已证明不同的HLA等位基因及其产物在炎症发病中起易感因素的作用［1］。HLA-DR与变应性血管炎的相关性也开始受到关注。我们通过检测变应性血管炎患者治疗前、治愈后HLA-DRw53基因mRNA表达量的变化，探讨HLA-DRw53基因在变应性血管炎患者发病中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 43例变应性血管炎患者，均来自皮肤科。男23例，女20例，平均年龄（42±5）岁，病程15d～3年。变应性血管炎治疗前组43例，变应性血管炎治愈组17例。正常对照组24名，男13名，女11名，平均年龄（33±1）岁。入选标准：符合赵辨主编，江苏科技出版社出版的《临床皮肤科学》诊断标准，健康志愿者均来自单位体检者。病史、体检、血清学检查以及脏器功能均未见异常。所有研究对象排除系统性红斑狼疮、高血压、糖尿病、冠心病以及其他与遗传相关的疾病。
1.2 治疗方法［2］ 根据不同原因及症状进行积极治疗。（1） 除去病因以减少抗原来源，驱除感染灶，如病毒细菌的感染。停用过敏药物及异性蛋白的影响。（2） 服用强地松20～40mg，分次口服。（3） 秋水仙碱0.5mg，每日服2次，（4） 阿斯匹林0.3g加潘生丁25mg，每日服3次。疗程均为4周。
1.3 疗效判定 根据赵辨主编，江苏科技出版社出版的《临床皮肤科学》疗效标准。治愈：皮疹和症状全部消失，或遗留瘢痕。30例治愈患者中随机选17例为治愈组。
1.4 样本采集及测定方法 采用低渗盐析法从外周血中分离白细胞，Trizol试剂提取白细胞总RNA，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其完整性和浓度。利用随机引物逆转录合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），根据人HLA-DRw53基因第二外显子序列和管家基因人磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的cDNA序列设计序列特异性引物。上游引物（HLA-DRw53A）：5’-GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT-3’,下游引物（HLA-DRw53B）: 5’-GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT-3’；GAPDH上游引物（GAPDHF）:5’TGGGTGTGAACCACGAGAA-3’，下游引物（GAPDHR）：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’。扩增片段HLA-DRw53为327bp,GAPDH为143bp，上述引物由上海生工生物公司合成。反应条件：94℃ 3min预变性；94℃ 30s变性；55℃ 30s复性；72℃ 1min延伸1个循环，共35个循环；72℃ 5min延伸；4℃短时保温。以管家基因GAPDH的cDNA起始模板数对HLA-D Rw53基因的起始模板进行标化，设定无cDNA样品的空白管作为阴性对照，以阳性产物不同对数的稀释浓度（107、106、105、104、103）和相应的阈值循环数为相应的X、Y轴制作标准曲线，根据各自标准曲线计算出起始模板RNA的浓度，标准曲线的回归系数＞0.96（r2=0.97），认为拟合满意。
1.5 统计学处理 所有数据经SPSS 10.0版软件进行χ2检验、t检验和单因素方差分析，显著水平为0.05（双测）。
2 结果
将各样品定量PCR结果得出的HLA-DRw53基因和GAPDH基因Gt值，根据下列公式计算HLA-DRw53基因cDNA拷贝数相对于GAPDH基因cDNA拷贝数的对数值（即校正后的相对拷贝数），进行单因素方差检验：对数值=（HLA-DRw53每个循环扩增的倍数）Gtl-Gtn /（GAPDH基因每个循环扩增的倍数）Gtl-Gtn；其中Gtn为第n个样本的Gt值，Gtl为第一个样本的Gt值（表1）。HLA-DRw53基因mRNA在治疗前组、治愈组以及正常对照组定量表达的情况经过单因素方差分析结果显示，治疗前组起始模板cDNA对数值为2.295±0.698。治疗前组HLA-DRw53基因mRNA表达明显与正常对照组和治愈组比较差异有统计意义（P＜0.01）；治愈组表达量与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
表1 各组HLA-DRw53基因表达结果比较（略）
注:与正常对照组比较,*P＜0.01，#P＜0.05。
3 讨论
本病以下肢发生红斑结节为主，有压痛，也可伴有紫癜、紫癜性丘疹、风团、丘疱等皮损。皮肤组织病理表现血管壁有炎性细胞浸润，主要为多核白细胞及纤维蛋白沉积，血管周围有多核白细胞浸润，伴有核尘及红细胞渗出。最常见于药物及感染等引起，此外有内在性的疾病，如冷冻蛋白血症，高球蛋白血症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等也可引起本病［3］。人类的主要组织相容性抗原称为人类白细胞抗原（HLA抗原），其中Ⅱ类抗原（HLA-DRw53）主要表达在活化的Mφ、B细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞、血管内皮细胞及活化的T细胞表面。HLA等抗原与患者血中的相应抗体结合，沉积于血管壁，激活补体，释放多种生物活性物质，引起血管壁通透性增高，中性粒细胞浸润，导致血管壁坏死。血小板凝聚及纤维蛋白沉积，并形成血栓，进一步加重血管壁的变性和坏死［4］。在以往对HAL-DRw53基因表达的研究中，多限于半定量的分析，不能在mRNA水平对待测基因做定量检测。荧光定量RT-PCR技术是在传统PCR方法的基础上发展起来的一种新的技术，反应体系中加入了与DNA双链特异结合的染料SYBR Green I，后者可以结合在新产生的双股DNA上，这样可以在每一个PCR循环的终点通过检测荧光信号的量即时检测扩增DNA的增加量。实时荧光定量RT-PCR技术它融合了PGR高灵敏性、DNA双链结合的高特异性和光谱技术的高精确性等优点，可以实时检测PCR过程中的荧光信号积累，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。整个过程在闭管状态下进行，避免了因污染导致的假阳性，使结果准确可靠，是一种较为先进的分子生物学技术。在HAT-DRw53基因与炎症的相关性以往的研究中，Lympany等［5］和Dekker等［6］的研究都发现，炎症中等位基因DRw53*0401出现频率均显著低于正常对照组，并认为DRw53*0401可能作为炎症的一个抗性基因。这些研究结果提示HLA-DRw53基因与变应性血管炎之间存在相关性，且可能作为变应性血管炎的一种抗性基因在抗原呈递中起作用，但对HLA-DRw53基因在变应性血管炎患者中的定量表达的情况国内外却鲜有报道。我们应用实时荧光定量RT-PGR法检测变应性血管炎患者HLA-DRw53基因mRNA定量表达情况发现，在变应性血管炎发病患者中表达显著增高，定量较为准确；但是在变应性血管炎治愈患者中却表达不高，提示该基因仅在变应性血管炎发病时表达增高，而在治愈不再高表达，这对指导变应性血管炎的病因研究以及治疗方向有一定的意义。尽管近年来国内外学者对HLA与变应性血管炎的关系进行了较多研究，取得了一定的成果，但由于不同研究者所用的研究方法、研究对象等不同，研究成果多不一致，而且目前多认为变应性血管炎是一种多基因病，单一基因的相关性往往缺乏说服力，需要进一步探讨完善。
【参考文献】
［1］ Ye Q, Finn PW, Sweeney R, et al. MHC class II-associated invariant lzxx II_- associated invariant chain isoforms regulate pulmonary immune responses［J］. Immunol, 2003, 170:1473～1480.
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［5］ Lympany MF, Welsh KI, Christie PE, et al. An analysis with sequence-specific oligonucleotide probes of the association between aspirin -induced asthma and astigens of the HLA system［J］. Allergy Clin Immunol, 1993, 92:114～123.
［6］ Dekker JW, Nizankowska E, Schmitz-Schumann M, et al. Aspirin-induced asthma and HL A-DRBl and HLA-DPB1 genotypes［J］. Clin Exp Allergy, 1997, 27:574～577.
作者单位：梅州市慢性病防治院,广东 梅州 514021； 梅州市人民医院,广东 梅州 514021; 广州金域医学检验中心,广东 广州 510330.