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【摘要】 目的 观察重型脑损伤后水通道蛋白-4（AQP4）表达变化，及其与脑损伤后脑水肿之间的关系。 方法 健康成年Wistar大鼠，随机分成创伤性脑损伤（TBI）组和各假手术（SO）组。自由落体硬膜外撞击方法致重度脑创伤模型。于伤后4h、8h、12h、1d、3d、5d、7d取出大鼠脑组织，免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）检测AQP4的表达变化，干湿重法计算脑组织含水量。 结果 IHC和ISH显示，脑损伤后AQP4在脑组织中的表达上调，1d达高峰，持续至3d后下降，7d接近SO组水平。与SO组相比，除7d亚组外，TBI其余各亚组中AQP4表达水平均明显增高（P<0.05）。脑损伤后4h脑组织含水量即比SO组增加（P<0.05），随时间延长，脑组织含水量亦逐渐增加，伤后1～3d达高峰。AQP4表达和脑组织含水量呈正相关，r＝0.978，P<0.01。 结论 脑损伤后，随着脑水肿加重，AQP4表达上调。提示脑损伤后AQP4的表达变化与脑水肿的形成密切相关，AQP4在损伤后脑水肿的形成中发挥着重要作用。
【关键词】 创伤性脑损伤；AQP4；脑水肿
The relationship between expression of AQP4 and brain edema in patients with trauma to brain.
LI Jun-ju, WANG Yu-tian, HUANG Cui-xue, et al.
（Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan, P. R. China）
Abstract：Objective To investigate the changes of AQP4 expression after traumatic brain injury （TBI）, and the relationship between the brain edema and AQP4 expression. Methods Healthy Wistar rats were randomly divided into TBI group and the sham operation （SO） control group. The TBI group was subjected to traumatic brain injury by the Feeney’s method. The brains of the animals were taken out 4h, 8h, 12h, 1d, 3d, 5d and 7d after TBI. Subsequently, the expressions of AQP4 and its mRNA were detected with IHC and ISH. The wet-dry weighing method was used to detect the brain water content. Results The expression of AQP4 was positive in cytoplasm and cytomembrane. After TBI, the expression of AQP4 up-regulated, and finally reached a peak 1～3d after TBI. The brain water content of brain tissue increased 4h after TBI, and reached its peak also 1～3d post-TBI. The brain water content correlated with AQP4 expression positively. Conclusion Both the expression of AQP4 and the brain water content of the brain tissue would increase after TBI, and they are positively correlated indicating that AQP4 may play an important role in the formation and development of brain edema.
Key words：Traumatic brain injury; AQP4; Brain Edema
脑水肿是重型颅脑损伤最常见的病理过程。脑组织损伤导致广泛的脑组织水肿、颅内压增高，危及患者的生命。故研究脑损伤脑水肿的发生、发展，探索其发生机制和演变规律，可为有效的干预脑水肿提供理论依据。近年来对水通道蛋白（Aquaporin, AQP）家族结构和功能的研究，揭示了其在水跨膜转运及细胞内外环境水平衡的调节中发挥了重要作用。AQP4在中枢神经系统分布最广，与调节脑内水平衡的关系最为密切［1］。因此，我们动态观察了大鼠重型颅脑损伤后AQP4表达强度的变化，研究AQP4的变化与脑水肿程度的关系，探讨AQP4在重型颅脑损伤后脑水肿发生、发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物和分组 健康Wistar大鼠80只，雌雄不限，质量200～280g。由海南省人民医院实验动物中心提供，符合国家二级实验动物标准。随机分成TBI组和SO对照组，按伤后4h、8h、12h、1d、3d、5d和7d分为7个亚组，每个TBI亚组5只大鼠，SO对照组3只大鼠。
1.1.2 主要试剂和仪器 兔抗鼠-AQP4单克隆抗体（Santa Cruz公司），恒温冰冻切片机（Leica公司），AQP4cDNA探针（由Primer Premier 5软件设计寡核昔酸探针，序列为5’-GACTCCTGTTGTCCTCCACCTCCATGTAGCTCCCTTTTTGTT-3’，用地高辛精药盒作末端标记，上海生工公司设计合成5’-端地高辛标记），SABC法免疫组化试剂盒、敏感性加强型原位杂交检测试剂盒II和DAB显色试剂盒（北京中杉公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的制作 采用改进Feeney’s［2］自由落体硬膜外撞击方法致局灶性重度脑创伤模型（40g×25cm）。SO组：除不予以撞击外，其余操作与TBI组相同。于伤后4h、8h、12h、1d、3d、5d和7d处死动物，留取标本待检测。若由于各种原因导致各实验组动物数目不足预定数额者，通过随机抽样原则补齐动物数目并重新造模。
1.2.2 创伤区脑组织含水量的测定 采用干湿重法。按设定时间点处死大鼠后迅速取脑，在伤灶中心取0.1g左右的脑组织，将取出的脑组织放在一个内有生理盐水湿润的定性滤纸的培养皿中，以防止水分蒸发。电子分析天平称其湿重，然后放入电热恒温箱中105℃烘烤至恒重，再称干重。脑组织含水量（%）=（湿重－干重）/湿重×100%。
1.2.3 免疫组化检测AQP4的表达 在各相应时间点经心脏用4%多聚甲醛（PFA）作预固定，迅速打开颅腔取出完整的大脑，放入4%PFA中后固定24h。然后常规进行石蜡包埋，作连续5μm切片。按常规SABC法进行免疫组化检测AQP4的表达。阴性对照：用PBS代替一抗。
1.2.4 原位杂交实验检测AQP4 mRNA的表达 在各相应时间点经心脏用4%多聚甲醛（PFA）作预固定，迅速打开颅腔取出完整的大脑，放入4%PFA中后固定24h。然后置入20%蔗糖中脱水，作连续15μm冠状切片，按试剂盒说明书的步骤进行原位杂交实验。
1.2.5 图像分析 光学显微镜下，对原位杂交和免疫组化的切片，选择5个不同视野采用Stratagene Eagle Eey II型图像分析处理系统进行定量分析。结果以细胞平均光密度值（OD）表示。
1.3 统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析和相关分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 脑组织含水量的变化 SO组脑组织含水量无明显改变；TBI组中脑组织含水量在伤后4h开始升高，1d达高峰，持续至3d后下降，7d达最低；除7d亚组外，TBI组中脑组织含水量均明显高于SO组，差异有统计学意义（P<0.05）,见图1。
图1 TBI后不同时间点脑组织的含水量（略）
2.2 免疫组织化学染色结果 AQP4表达以细胞膜出现棕黄色，而胞浆及胞核不着色为阳性。AQP4在SO组脑组织中呈弱阳性表达，各亚组间相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。在TBI组中，AQP4在伤后4h开始升高，1d达高峰，3d后下降，7d接近SO组水平。与SO组相比，除7d亚组外，TBI其余各亚组中AQP4表达水平均明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）,见图2。
2.3 原位杂交结果 SO组和TBI组AQP4 mRNA的表达结果与免疫组化相似,见图2。
2.4 脑组织含水量的变化与AQP4表达变化的相关性 相关分析显示：TBI后AQP4及其mRNA的表达变化呈显著正相关，r=0.989，P<0.01；与脑组织含水量的变化也呈正相关，r＝0.978，P<0.01。
图2 各组IHC和ISH的图像分析结果（略）
3 讨论
重型颅脑损伤是神经外科一类常见病、多发病，可引起严重的神经损伤，病死率与致残率都很高。脑水肿是重型颅脑损伤中常见的并发症之一，引起颅内高压而加重病情，甚至造成病人死亡。脑水肿的发生存在着脑微循环障碍、脑代谢障碍、血脑屏障破坏、自由基增加、钙超载、膜分子结构紊乱等多种学说，然而这些学说均不能对其发生机制作出圆满的解释。水分子的主动转运和平衡调节需要水通道蛋白（AQP）参与。目前在哺乳动物组织中已经发现了10种AQP，其中水通道蛋白-4（AQP4）在脑组织中分布最广，它主要分布在中枢神经系统的星形胶质细胞膜以及与脑脊液密切接触的界面上［3,4］。研究表明AQP4与脑水肿的形成密切相关［5,6］。因此，探讨AQP4在TBI后脑水肿的发生机制中的具体作用，对阐明脑水肿发生的病理生理过程，以及临床预防和治疗脑水肿将提供重要的理论依据。研究显示，重型颅脑损伤后4h脑组织含水量就增加，伤后1d达高峰，持续至3d，然后下降，第7d达最低，接近SO组水平。Andrew等［7］在缺血性脑水肿的模型中观察到：脑水肿在缺血2～3d最明显，以后处于平台期维持约一周。崔向宁［8］等研究发现，脑创伤后1～3d脑水肿最严重，5d仍高于正常，7d后水肿消退。与我们实验中观察到的结果基本一致。TBI后，伤区AQP4及其mRNA的表达在伤后4h开始升高，伤后1d达高峰，持续至3d后下降，第7d接近SO组水平。与SO组相比，除7d亚组外，TBI其余各亚组中AQP4表达水平均明显增高（P<0.05）。随着伤后脑水肿程度加重，AQP4的表达增强。这说明AQP4的表达变化与TBI后脑水肿的形成密切相关。本实验表明AQP4与脑损伤后脑水肿的形成密切相关。许多实验研究表明清除AQP4可以使急性水中毒或缺血性中风引起的脑水肿程度明显减轻，神经功能恢复加快，证实AQP4参与脑水肿的形成［9,10］。蛋白激酶C（Protein kinase C, PKC）激动剂-沸波醇二磷酸钠和佛波醇肉豆蔻酸乙酸盐可明显刺激AQP4磷酸化，并以剂量依赖的形式抑制AQP4的活性。后两者可以分别使有AQP4表达的卵母细胞的肿胀程度降低87%和92%［11］。说明蛋白磷酸化可以抑制AQP4的活性。这些结果提示，抑制AQP4的表达或促进其蛋白磷酸化，可以减轻脑损伤脑水肿，这为我们研发治疗脑水肿的新药提供新思路。
【参考文献】
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作者单位：海南省人民医院神经外科,海南 海口 570311.