HPLC-ELSD法测定硫酸妥布霉素注射液含量

【摘要】  目的 建立高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定硫酸妥布霉素注射液含量的方法。 方法 选择Zorbax SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,以1%三氟醋酸水溶液-甲醇（90∶10）为流动相,流速1ml/min; 蒸发光散射检测器,漂移管温度40℃,载气压力3.5Bar。 结果 妥布霉素在0.4～1.6mg/ml的范围内呈较好的线性关系（r=0·9998）,平均回收率99.8%,RSD=0.46%;系统精密度RSD=0.51%。 结论 方法操作简便、快速以及精密度、准确性、重现性均能很好地满足质量控制的要求，是一种比较理想的硫酸妥布霉素注射液含量测定分析方法。

【关键词】  高效液相色谱法；蒸发光散射检测器；硫酸妥布霉素注射液

Determination of tobramycin sulfate injection by HPLC-ELSD method.

　　YAN Yan, WANG Kang-jun.

　　（Hainan Provincial Institute for Drug Control, Haikou, 570216,Hainan,P,R.China）

　　Abstract：Objective  To establish an HPLC-performance liquid chromatograph（HPLC）-evaporative light-scattering detection （ELSD） method for determination of tobramycin sulfate.  Methods  The chromatography was performed on a column of Zorbax SB C 18（（250mm×4.6mm,5μm）. The mobile phase was 1% Trifluoroacetic -methanol（90∶10） withthe flow rate of 1ml·min-1，The drift tube temperature of 40℃ and ELSD was used as the detector with pressure of nebulizing gas of 3.5Bar.  Results  The linear calibration curve was in the range of 0.4～1.6mg·ml-1，r=0. 9998. The recovery was 99.8%, RSD=0.46%.The precision of the system was satisfactory （RSD=0.51%）.  Conclusion  It is a simple, rapid, accurate and reproducible method of quality control for determination the content of tobramycin sulfate injection.

　　Key words：HPLC evaporative light-scattering detection （ELSD）; Tobramycin sulfate injection

　　妥布霉素（Tobramycin ） 为氨基糖甙类抗生素药,是从黑暗链霉菌（Strop tonzyces tenebrarius）发酵液中提取得到的具有广谱抗菌活性的氨基糖二类抗生素。具有疗效高，毒性低的特点。由于氨基糖甙类抗生素无紫外吸收,无法采用紫外检测器。含量测定一般采用微生物效价测定法、旋光法［1］、UV衍生化法［2］、HPLC衍生化法［3］，但微生物效价测定法和旋光法不能排除产品中存在的理化性质与妥布霉素相近的其他氨基糖甙类杂质的干扰，而且该方法操作烦琐、费时,而且反应过程中可能会产生一些副产物,干扰测定。近年来陆续有文献报道用蒸发光散射检测器进行氨基糖甙类抗生素的质量分析［3］ ，蒸发光散射检测器是一种新型的通用型质量检测器,ELSD的响应不依赖物质的光学特征,对无紫外或紫外末端吸收的有机化合物的检测,显示出极大的优越性，2005年版中国药典己收载蒸发光散射检测技术和相关品种。目前未见用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定硫酸妥布霉素注射液含量的方法的报道。2005年版中国药典采用微生物效价测定法，本研究建立了在酸性条件下HPLC-ELSD法测定硫酸妥布霉素注射液含量的方法,并经测定的结果与“2005年版中国药典”中收载的微生物检定法的测定结果基本一致。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂  岛津高效液相色谱系统2010CHT型和SEDEX 75型蒸发光散射检测器;Zorbax SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）。三氟醋酸为TEDIA COMPANY INC产品,分析纯;水为自制双蒸水。妥布霉素对照品含量91.4%,批号130527-200402,由中国药品生物制品所提供；硫酸妥布霉素注射液由江西华阳际制药有限公司提供，批号：06090401、06052102；宜昌人福药业有限公司  批号：060903；规格：2ml;80mg（80万单位）

　　1.2  色谱条件  采用1%三氟醋酸水溶液-甲醇（90∶10）为流动相,流速为1ml/min;ELSD检测器漂移管温度为40℃, 载气压力3.5Bar;进样量10μl。

　　1.3  溶液的配制  取妥布霉素对照品,精密称定,用水溶解,分别制成浓度为0.4、0.6、1.0、1.2、1.4mg/ml的对照品溶液,每个浓度平行配制两份；精密量取供试品硫酸妥布霉素注射液,用水制成浓度为1.0mg/ml的溶液,平行配制6份。

　　1.4  线性关系考察  精密称取妥布霉素对照品适量,加水制成含妥布霉素0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4及1.6mg/ml的溶液, 分别进样10μl, 以浓度的常用对数为横坐标,以峰面积的常用对数为纵坐标作图,计算出回归方程,Y=1.1518X+7.5459， r=0.9998, 妥布霉素在0.4～1.6mg/ml的范围内呈良好的线性关系。

　　1.5  精密度考察  取对照品溶液,连续进样6针,以主峰峰面积计算,RSD为0.42%。

　　1.6  稳定性考察  取供试品（批号；06090401）溶液,分别于0、1、2、4、6、8h取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,RSD为0.82%。

　　1.7  重复性试验考察  取同一批（批号；060904011）供试品，配制成6份溶液，分别进样分析，含量测定结果的RSD为0.51%（n=6）。

　　1.8  回收率考察  精密称取已知含量的硫酸妥布霉素注射液适量（高、中、低各3份）和与之相对应量（按硫酸妥布霉素注射液处方比例）的妥布霉素对照品9份，分别置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μL注入液相色谱仪进行测定,计算回收率，测得回收率分别为99.8% , 99.6% ,99.7%。平均回收率为99.8%，RSD=0.46%,表明回收率良好。
　　
　　1.9  含量测定  取妥布霉素对照品溶液,进样,记录色谱图,以峰面积（A）的对数（ Y）对浓度（C）的对数（X）进行线性回归,所得线性方程为:Y=aX+b,即:lgA=algC+b；取供试品溶液,分别平行进样,测定供试品溶液主峰的平均峰面积（A）,并根据对照品标准曲线计算供试品溶液中妥布霉素的浓度［10∧（lgA-b）/a］,然后再根据供试品溶液的稀释（V）和称样量（W）,计算供试品中妥布霉素的含量。

　　2  结果

　　2.1  采用本法测定硫酸妥布霉素注射液3批的含量,结果见表1。硫酸妥布霉素注射液供试品溶液的色图谱见图1。

　　2.2  微生物检定法测定与HPLC-ELSD法测定含量结果的比较  微生物检定法  按中国药典2005年版测定方法，采用二剂量法测定硫酸妥布霉素注射液含量。结果采用微生物法测定同与HPLC-ELSD法测定含量结果非常接近见表1。
　　
　　图1  硫酸妥布霉素注射液HPLC色谱图（略）

　　Fig 1  Tobramycin sulfate HPLC chromatigram
 
　　1：硫酸根［SO-24］；2：妥布霉素［tobramycin］

　　3  讨论

　　3.1  本文所建立的HPLC-ELSD方法测定硫酸妥布霉素注射液的含量较目前中国药典采用的效价方法及其他旋光法、UV衍生化法HPLC衍生化法相比，有以下优点:本方法不需要进行衍生化，排除产品中存在的理化性质与妥布霉素相近的其他氨基糖甙类杂质的干扰，减少了样品的前处理所带来的误差，提高了分析的精度,结果准确。

　　表1  HPLC-ELSD法与微生物检定法含量测定结果（略）

　　Tab 1  Determination results of HPLC-ELSDand Antibiotics-Microbial Assays

　　3.2  利用对照品标准曲线法,测定硫酸妥布霉素注射液的含量,测定的结果与微生检定法的结果差异甚微,说明本方法具有较好的准确性。不仅样品预处理简单,无须衍生就可以用其测定硫酸妥布霉素注射液含量,方法简便、快速、可靠。能很好地满足质量控制的要求。

　　3.3  有文献报道［4］用流动相为0.2mol/L三氟乙酸溶液-甲醇系统测定妥布霉素的含量［4］，但只有测定原料的含量报道，未见对硫酸妥布霉素注射液的含量测定方法进行研究，本文参照HPLC ELSD法测定妥布霉素的含量测定方法［4-5］ 建立的HPLC-ELSD法测定硫酸妥布霉素注射液的含量的方法，结果可靠，可行。

【参考文献】
  ［1］ 董永成，杜士明.妥布霉素口服液的制备及质量控制［J］.中国医院药学杂志，2006，26（8）:1015.

　　［2］ 赵风琴，陈维娜.硫酸妥布霉素注射液含量［J］.沈阳药科大学学报，1997，14（20）：120.

　　［3］ 肖大伟，郭宏. HPLC法测定复合维生素B液中妥布霉素的含量［J］.江苏药学与临床，2003，11（3）:14.

　　［4］ 洪利娅，陈悦，陈贵斌，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定妥布霉素的含量［J］.中国抗生素杂志, 2005，30（11）：662.

　　［5］ 中华人民共和国药典委员会.中国药典2005年版（二部）［M］.北京：化学工业出版社，2005，719.

作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216.