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【摘要】 目的 建立SYBR Green I 荧光PCR 快速检测登革热病毒的方法。 方法 以通用引物对标准株提取物和血清样本进行RT-PCR 扩增, 同时以SYBR Green I标记进行实时PCR扩增，分析其灵敏性特异性和重复性。 结果 标准毒株的扩增结果与预期结果相同, 测序结果显示实验结果序列与标准株序列一致。实验的灵敏性特异性和重复都较高。 结论 SYBR Green I 荧光PCR 检测登革热病毒的方法是一个快速、准确检测登革热的方法, 但它更适用于早期传染病监测。
【关键词】 登革热病毒 PCR SYBR Green I
Establishment of methods for detection of dengue virus by real-time quantitative RT-PCR with SYBR Green I.
WANG Dian-peng, ZHU Yu-lan, WU Bing,et al.
(International Travel Health Care Center of Shenzhen Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau , Shenzhen 518033; Shenzhen Municipal Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518033, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To develop a real－time quantitative RT－PCR method with SYBR Green I to detect dengue virus. Methods The optimal conditions and system of real-time PCR using SYBR Green I were established. The sensitivity and specificity and repeat were analyzed. Results The size of amplified products of the standard virus was obtained as expected. The sequencing results revealed that the amplified products sequences consisted of the standard dengue sequences in NCBI. The sensitivity, specificity and reproductivity of SYBR Green I real-time PCR was high. The specification of amplified products was checked by melting curve analysis. Conclusion The established SYBR Green I real-time PCR is a rapid, specific and sensitive method for the detection of Dengue virus. It can be used for monitoring of early dengue infection.
Key words：Dengue virus; Real time RT-PCR; SYBR Green I
登革病毒(Dengue Virus ,DEN) 是经白纹伊蚊及埃及伊蚊传播的披膜病毒科黄病毒属病毒家族的成员, 血清学上根据E 蛋白抗原性不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型 ［1 ］ 。DEN 感染人类不仅可引起登革热(Dengue fever,DF), 还可引起登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF) 和登革休克综合症(Dengue shock syndrome,DSS),可导致30%～40%的患者死亡。据估计全世界每年登革热发病人数约6 千万,受威胁人口约25 亿,已成为世界上分布广、发病率高、危害较大的一种虫媒病毒性疾病,成为全球性重要公共卫生问题［2 ］。登革热病毒主要流行于热带及亚热带地区,近年来我国东南沿海地区尤以广东多次发生登革热流行。因此，卫生防疫部门务必要加强登革热病毒检测预警。DEN 的经典诊断方法为病毒分离,但该方法周期长。SYBR Green是结合于双链DNA 的荧光染料, 可在定量PCR 反应时与双链PCR 产物结合放出荧光信号, 被仪器系统实时监控并检测。目前SYBR Green 荧光定量PCR 方法在传染性疾病的诊断等方面有重要的应用价值［3～7 ］。本研究根据CLWSTAL软件对DEN基因4个型进行对比分析，设计通用引物，建立了SYBR Green I 荧光PCR 方法, 并研究了该方法的灵敏度、特异性以及重复性，报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 登革热病毒4个基因型标准株提取物由广东出入境检验检疫局P3实验室惠赠。
1.2 标本 2006年5月以来，深圳出入境检验检疫局登革热IgM抗体阳性人血清。
1.3 引物 实时荧光定量所用引物是用Primer5.0 设计,来自于登革热病毒4个基因上高度保守的基因序列(图1) 。特异性通用引物序列为：5-AGTGGAGTGGAAGGAGAAGGG3’，5’-ATTCTTGTGTCCCATCCGGCTGT-3’。
1.4 Real－time PCR 仪 本研究中用到的Real－time PCR 仪是Roche 公司的LightCycler ,软件版本是3.5。
1.5 RNA提取 200μl样品用Qiagen QIAamp RNA提取试剂提取RNA。
1.6 传统巢式RT-PCR基因分型检测 方法参考Lanciotti RS,Calisher CH,Gubler D检测方法［8 ］。
1.7 SYBR Green I实时PCR及反应条件 总反应体系为20μl。内含:2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix 10μl;上游引物、下游引物(10 μmol/μL)各1μl, 终浓度为015μmol/μl;QuantiTect RT Mix 0.12μl;模板1μl;无RNase水6.8μl。反应条件为:50℃ 20min ( ×1),95℃ 10min ( ×1),94℃ 15s→59℃ 20s→72℃30s( ×45) 测定吸光值,即在每个循环结束后测定吸光值。随着PCR 系统在每一个循环结束后测定吸光值,得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标,Ct 值为纵坐标的标准曲线。
1.8 熔点曲线的测定 熔点曲线的测定是90℃ 0s,45℃ 45s,然后每秒0.2℃升温到95℃测定吸光值。
1.9 琼脂糖凝胶电泳，测序。
1.10 特异性实验 分别用登革热病毒4个基因型、HCV、HEV、HIV的RNA提取物为对照模板进行SYBR Green I进行实时PCR检测。
1.11 敏感性实验 对阳性样本以10倍梯度进行稀释，最大稀释倍数为100万倍，然后以各稀释液为模板进行SYBR Green I进行实时PCR检测。
1.12 重复性实验 重复测定阳性RNA 五次,分别得到五个Ct 值,计算Ct 平均值、标准差和变异系数。
2 结果
2.1 定性曲线 各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值,接下来一直到第5 个循环结束时都没有明显变化。从第6 个循环开始其中的一个反应的吸光值增大,定量曲线开始抬头,15 个循环(Ct 值) 后,曲线迅速上扬,至第30 个循环前后达到峰值,随后进入平台期,一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线（图2）。
图1 登革热病毒4个基因型对比（略）
（*代表相同序列，□代表引物选择区）
图2 SYBR Green I实时PCR检测反应曲线（略）
2.3 琼脂糖凝胶电泳结果 产物DNA片段大小与目的片段大小一致（图3），测序结果经NCBI-Blast对比为DENGUE序列。
图3 反应产物琼脂糖凝胶电泳（略）
(M为100bp Marker,N为阴性对照；1、2、3为阳性反应物)
3 讨论
迄今，登革热病毒的检测最原始、经典的方法是特异性病毒分离培养，但由于操作繁琐、技术难度大耗时长、实验条件要求高、并存在严重的生物安全问题，在实际工作中难以推广应用。ELISA法与病毒分离培养及基因检测法相比，会产生一定的假阳性［9］。近年来实时PCR检测技术的推广应用给登革热病毒检测提供了可靠的理论和实践基础。实时PCR技术保持了传统PCR检测技术的灵敏性等优点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。而且还有重复性好、省力、快速等优点。
为了将实时PCR技术广泛应用于热带地区危害较大的登革热传染病检测，本研究使用了SYBR Green I作为荧光指示剂进行实时PCR扩增。通过优化反应体系和反应条件，与传统方法比较，使建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有高敏感性和高特异性，满足登革热病毒检测的需要。
研究过程发现SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR与巢式RT-PCR相比，具有线行关系好、线性范围宽等特点;并且,扩增和检测在同一管内完成,不需要开盖,不需要电泳检测PCR产物,有效解决了污染问题［10］。同时,大幅缩短了反应时间,本研究中我们应用Roche LightCycler可在2h左右完成32个RNA样本的RT－PCR反应。本研究建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测登革热病毒的方法将RT-PCR扩增及PCR产物检测一体化，在封闭的均相系统内进行，提高了样品分析速度，简化了操作步骤，减少了扩增引起污染的机会。其方法操作方便、特异性较强、灵敏度较高，可代替传统RT-PCR方法，用于登革热病毒的监测。但该方法与荧光特异性探针实时PCR检测比较，其检测特异性、灵敏性还有一定差异。
【参考文献】
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作者单位：深圳出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心，广东 深圳 518033；深圳市检验检疫科学研究院，广东 深圳 518033；内蒙古察右后旗医院，内蒙古 乌兰察布 012400