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【摘要】 目的 消除环酯红霉素原料的微生物限度检查法中的抑菌作用。 方法 细菌采用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌用平皿法进行试验，加试验菌回收并且计算回收率。 结果 菌回收率达到70%以上，控制菌检查用薄膜过滤法才达到要求。 结论 薄膜过滤法可消除药品中抑菌物质的干扰。
【关键词】 微生物限度检查法 验证试验 抑菌 回收率
建立药品微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定和控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法和检查方法应重新验证。有些制剂本身有抑菌作用, 制备的供试液本身影响微生物的生长，若不做方法学验证，所采用方法不一定适合该供试品的微生物限度检查。有了系统的方法学验证，可以避免因为选择方法不合理而造成漏检、误判，以保证结果的科学可靠。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品 环酯红霉素原料,批号：051027,规格：原料, 生产单位：欧洲波兰波尔法－塔赫敏制药股份公司。
1.1.2 培养基及稀释剂 玫瑰红钠琼脂、营养琼脂、营养肉汤、真菌培养基、胆盐乳糖培养基，MUG、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.1%蛋白胨水，均由中国药品生物制品检定所培养基室提供。
1.1.3 验证试验用菌种 金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003、枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63 501、大肠埃希菌CMCC(B) 44 102、 白色念珠菌CMCC(F) 98 001、 黑曲霉 CMCC(F)98 003，均由海南省药品检验所提供。
1.1.4 主要仪器 STV3型无菌检查薄膜滤器（浙江宁海白石药检仪器厂），303AS-2型数显隔水式电势培养箱（上海浦东荣丰科学仪器公司），SPX-25型生化培养箱（上海跃进医疗器械厂）。
1.2 方法
1.2.1 菌液制备
1.2.1.1 细菌 取经35～37℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1ml加9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至105～107，控制细菌数约为50～100cfu/ml。
1.2.1.2 酵母菌 取经23～28℃培养18～24h的白色念珠菌液体培养物1ml加9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至105～107，菌数约为50～100cfu/ml。
1.2.1.3 霉菌 取经23～28℃培养7d的黑曲霉菌斜面培养物，加3～5ml灭菌生理盐水洗下霉菌孢子，吸出菌液（管口带有薄的无菌棉花的无菌毛细吸管），取1ml 加9ml灭菌生理盐水，逐管10倍稀释为104，菌数约为50～100cfu/ml。
1.2.2 供试药液的制备 称取供试药品(环酯红霉素)10g溶于100ml无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，作为1:10的供试药液。
1.2.3 细菌计数方法的验证试验方法
1.2.3.1 实验方法 中国药典2005年版二部附录微生物限度检查法中的薄膜过滤法。
1.2.3.2 回收率测定
1.2.3.2.1 试验组 取1:10供试药液,以500r/min离心5min,分别取上清液1ml于薄膜过滤,以0.1%蛋白胨水冲洗,每次100ml,最后一次加入1ml金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌液,过滤后取出滤膜,分别菌面朝上贴于营养琼脂平皿中30～35℃培养48h观察结果，逐日点计菌落数，以48h的菌落数报告。
1.2.3.2.2 菌液组 测定每一菌株的试验菌数,采用平板菌落计数法。
1.2.3.2.3 供试药品对照组 不加菌液，其它操作同试验组，测定样品本底菌数。
1.2.3.2.4 稀释剂对照组 取无菌pH值7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,按照试验组的冲洗量过滤,在最后一次冲洗中逐一加入试验菌液1ml, 过滤后取出滤膜, 其它操作同试验组。
表1 薄膜过滤法各试验菌回收率（略）
表2 薄膜过滤法各试验菌回收率（略）
表3 薄膜过滤法各试验菌回收率（略）
1.2.3.3 回收率计算公式 试验组的菌回收率(%)=（试验组菌落数均值-供试品对照组菌落数均值）/菌液组菌落数均值×100%稀释剂对照组回收率(%)=稀释剂对照组菌落数均值/菌液组菌落数均值×100%。
1.2.4 霉菌和酵母菌计数的验证试验方法
1.2.4.1 实验方法 中国药典2005年版二部附录微生物限度检查法中的常规平皿法。
1.2.4.2 回收率测定
1.2.4.2.1 试验组 取2组平皿,每组2个,分别加入1：10的供试药液1ml,再分别加入1ml白色念珠菌、黑曲霉菌菌液,分别倒入15ml玫瑰红钠琼脂,于23～28℃培养72h观察结果，逐日点计菌落数，以72h的菌落数报告。
1.2.4.2.2 菌液组 不加供试药液，其它操作同试验组，测定每一菌株的试验菌数。
1.2.4.2.3 供试药品对照组 不加菌液，其它操作同试验组，测定样品本底菌数。
表4 常规平皿法各试验菌回收率（略）
1.2.4.3 回收率计算公式 试验组的菌回收率(%)=（试验组菌落数均值-供试品对照组菌落数均值）/菌液组菌落数均值×100%
1.2.5 控制菌(大肠埃希菌)检查方法的验证
1.2.5.1 实验方法 中国药典2005年版二部附录微生物限度检查法中的薄膜过滤法。
1.2.5.2 菌液制备 取经37℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml加9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至10６，细菌数约为10～100cfu/ml。
1.2.5.3 大肠埃希菌的验证
1.2.5.3.1 试验组 取1:10供试药液, 以500r/min离心5min,分别取上清液10ml于薄膜过滤,以0.1%蛋白胨水冲洗,每次100ml,最后一次加入1ml大肠埃希菌液,过滤后取出滤膜在100ml胆盐乳糖培养基中培养，35～37℃培养 24h。
1.2.5.3.2 阴性对照组 取1:10供试药液10ml，薄膜过滤,以0.1%蛋白胨水冲洗,每次100ml,最后一次加入1ml金黄色葡萄球菌液,过滤后取出膜在100ml胆盐乳糖培养基中培养，35～37℃培养 24h。
取上述培养物各0.2ml接种至5mlMUG培养基试管内，35～37℃培养，于5h、24h在365nm的紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。
表5 薄膜过滤法大肠埃希菌验证结果（冲洗量1 000ml）（略）
注:“＋”代表反应阳性， “－”代表反应阴性。
2 结果
2.1 细菌计数法验证试验结果及判断 结果详见表1～表3。从表1～3结果可知,取上清液1ml薄膜过滤法处理后,冲洗量小于1 200ml时,人工污染金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的试验组菌回收率均低于70%，不符合验证的要求; 冲洗量为1 200ml时,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的菌回收率均高于70%,符合规定验证的要求。
2.2 霉菌和酵母菌计数验证试验结果及判断 结果见表4。从表4结果可知，采用常规平皿法测定霉菌和酵母菌数，人工污染白色念珠菌、黑曲霉菌试验组的菌回收率均高于70%，符合规定验证的要求。
2.3 控制菌(大肠埃希菌)检查方法的验证结果及判断 结果见表5。从表5结果可知，采用薄膜过滤法检查大肠埃希菌，冲洗量为1 000ml，结果符合规定验证要求。
3 讨论
3.1 一个药品要做微生物限度检查时,应该怎样去操作，什么方法才最适合这个品种，是常规平皿法还是薄膜过滤法等,是要根据药品的性质选用你认为适宜的一个方法或几个方法进行试验来验证你所选用的方法是否可行。只有这样你的试验才是科学的。
3.2 从上述结果可知，环酯红霉素原料的微生物限度检查中的霉菌和酵母菌数可依据中国药典2005年版二部附录微生物限度检查中的常规平皿法进行；细菌数、控制菌检查可用薄膜过滤法进行,即取本品10g溶于100ml的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，以500r/min离心5min,分别取上清液1ml、10ml薄膜过滤,以0.1%蛋白胨水冲洗, 冲洗量分别为1 200ml、1 000ml。
3.3 环酯红霉素原料本身具有抑菌作用, 制备的供试药液会影响微生物的生长，做微生物限度检查法的验证试验证明，细菌、控制菌选用薄膜过滤法，可消除药品中抑菌物质的干扰，得到准确的测定结果。
3.4 由以上验证实验证明，做微生物限度检查法的验证是很有必要的，若不做验证实验，所做的实验结果就不一定准确、可靠。微生物限度检查法验证，还可以为药品监督管理部门提供一个准确的可靠的方法学试验，以避免各个药厂五花八门的药品，药检所不知用哪个方法更可靠。同一种药不同药厂生产,由于其处方上有差异或生产、检验人员不同其药品存在质量差异，如果各个药厂对自已生产的药都做了微生物限度检查方法学验证，这样药品监督管理部门的工作不仅省事而且能更好的把好质量关，希望各个药品企业都行动起来把这项工作做好。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典［M］.北京:化学工业出版社,2005，二部附录：93.
［2］ 马绪荣,苏德模. 药品微生物学检验手册［M］.北京:科学出版社,2001:40
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［4］ 裘雪友.药师手册［M］.第2版.北京：人民军医出版社，2003.
作者单位：海南澳美华制药有限公司,海南 海口 570216.