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【摘要】 目的 探讨BacT/ALERT 3D全自动培养仪在结核病诊治中的应用价值。 方法 用BacT/ALERT 3D全自动培养仪（3D法）对临床送检的402份标本（其中结核病患者标本330份，非结核病患者标本72份）进行结核分枝杆菌分离培养，阳性者进行药物敏感性试验，同时与BACTE TB 460系统（Bactec法）和改良罗氏培养法（L－J法）进行比较。 结果 330份结核病患者标本中，3D法、Bactec法和L－J法的阳性分离率分别为42.1%、43.9%和31.2%；初分离平均阳性时间为16.1d、12.8d和25.6d，平均药敏时间12.9d、12.4d和22.4d，总报告时间分别为29d、25.2d和48d。3D法在阳性分离率和平均报告时间均明显优于改良罗氏法（P＜0.05）、与Bactec法相近（P＞0.05）。3种方法污染率分别为4.0%、6.2%和3.5%；3D法低于Bactec法（P＜0.05）、与L－J法相近（P＞0.05）。3D法与Bactec法和L－J法药敏总符合率分别为97.28%和94.79%。在72份非结核病人标本中，3种方法培养均为阴性。 结论 BacT/ALERT 3D全自动培养仪检测分枝杆菌具有阳性分离率高、快速、污染率低、安全可靠、自动化程度高，是一种比较理想的快速检测分枝杆菌的方法。
【关键词】 BacT/ALERT 3D 分枝杆菌 结核 培养方法
Applied clinical research on detection of Mycobacteriam with automatic culture.
LIAO Guang-fu, LAN Hong.
(Longtan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545005, Guangxi, P. R. China)
Abstract：Objective To investigate the applied value of BacT/ALERT 3D full automatic culture instrument in tuberculosis diagnosis. Methods We used BacT/ALERT 3D full automatic culture instrument to cultivate 402 samples (including 330 tuberculosis samples and 72 non tuberculosis samples) for tuberculous Mycobacterium,if the result was positive,we would take drug sensitive test,and compared with another methods from BACTE TB 460 system,such as Bactec method and L-J method. Results Three metheds cultivatd 330 samples from pulmonary tuberculosis patients, the results were following:positive rate:3D 42.1%,Bactec 43.9%,L-J 31.2%;Beginning separate mean time:3D 16.1d,Bactec 12.8d,L-J 25.6d;mean drug sensitive time:3D 12.9d,Bactec 12.4d,L-J 22.4d;finally report time: 3D 29d ,Bactec 25.2d,L-J 48d.3D in positive separate rate and mean report time was significant better than L-J(P<0.05) and similar than Bactec(P>0.05);the contamination rate in 3D,Bactec and L-J were 4.0%,6.2% and 3.5%;3D was lower than Bactec(P<0.05) and similar than L-J(P>0.05).The total coincidence rate of drug sensitive between 3D and Bactec was 97.28%, between 3D and L-J was 94.79%.In 72 non-tuberculosis samples,the culture results of these three methods were negative. Conclusion BacT/ALERT 3D full automatic culture instrument tests mycobacterium is higher positive rate,speed,lower contamination rate,safe and automatic level higher,is an ideal speed test mycobacterium method.
Key words：BacT/ALERT 3D； Mycobacterium; Tuberculosis； Culture
结核分枝杆菌培养是结核病细菌学检查的金标准［1］。但传统改良罗氏培养方法（L-J法）存在检测周期长，分离率低等弊端；Bactec TB 460系统（Bectec法），虽可大大缩短了初分离时间和提高阳性率，对结核病的快速诊断和治疗起到了积极作用，但由于该系统存在放射性污染问题，在发达国家和我国部分城市已禁止使用；BacT/ALERT 3D全自动培养仪（3D法），该系统采用培养全封闭式的比色法原理，从而解决了放射性污染问题。龙潭医院2004年引进了BacT/ALERT 3D-240 全自动培养仪并应用于临床，为了解该系统的临床应用效果，本组用此方法与Bacte法、L-J对临床送检402份标本进行平行对比研究，结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源 龙潭医院门诊和住院病人标本共402人份（包括痰328份、胸水18份、脑脊液10份、脓6份、关节液2份、肺泡灌洗液28份）。其中结核病人标本330份，非结核病人标本72份。
1.2 仪器与试剂 （1）Bactec TB 460系统及其配套试剂由美国B-D公司提供。（2）Bactec/ALERT 3D 240全自动培养仪及其配套试剂由法国生物梅里埃公司提供。(3)改良罗氏培养基按《规程》［2］自制。
1.3 前处理方法 用N-乙酰-L半胱胺酸-氢氧化钠法（NALC-NaOH）。消化液的配制：4% 氢氧化钠50ml+2.94%柠檬酸钠50ml+N-乙酰-L半胱氨酸0.5g，临用前新鲜配制。用吸管吸取痰液干酪样部分(或胸水、肺泡灌洗液、混浊的脑脊液离心后取沉淀物)2ml加于50ml无菌尖底离心管内，加入等量消化液，置旋涡混均器上混均15～20s至样本被液化后放室温15min。加入无菌pH6.8PBS缓冲液至50ml刻度，平衡、锁紧盖子后，颠倒混匀，放入离心机3 000g离心15min。弃去上清液，于沉淀中加入pH6.8 PBS 1.5ml充分混匀成悬浮液。
1.4 培养及结果判断 用无菌注射器吸取标本悬浮液注入3种培养基中，各0.5ml。余下的操作和结果判断,Bectec法和3D法按仪器操作说明书要求、L-J法按《规程》［2］要求进行。
1.5 药敏试验 按各方法要求进行，同时用标准菌株（H37Rv）全敏感株进行质量控制。
1.6 统计学处理 计数资料采用χ2检验，计量资料用t检验。
2 结果
2.1 3种培养方法检测330份结核病患者标本的结果比较，见表1。
表1 330份结核病患者标本3种方法阳性率比较（略）
注：3D法与Bactec法比较χ2＝1.47，3D法与J－L法比较χ2=34.03
2.2 3种培养方法平均报告时间比较，见表2。
表2 3种方法平均报告结果时间（d）比较（略）
注：3D法与Bactec法比较t=1.245，3D法与J－L法比较t=4.612
2.3 3种培养方法的污染率比较，见表3
表3 402份标本3种方法污染率比较（略）
注：3D法与Bactec法比较χ2=4.27，3D法与J－L法比较χ2=0.57
2.4 3种方法培养均阳性者101例，分别用4种抗结核药物进行药物敏感性试验，其结果符合率，见表4。
表4 3D法药敏试验检测结果与Bactec法、L-J法符合情况（略）
3D法与Bactec法、L－J法药敏总符合率分别为97.28%和94.79%。
2.5 在72份非结核病人标本中，3种方法培养结果均为阴性。
3 讨论
目前结核病的确诊主要有赖于病原学检查，涂片法阳性率低且不能区别死菌与活菌，结核菌的裂殖周期较长，用传统的L－J法检测，虽然方法简单、经济、易于推广，但培养周期长、培养和药敏共需要2～3月，难以满足临床对结核病的诊断和治疗。自1977年Bactec-460系统问世以后，Bactec系统通过测量分枝杆菌在生长繁殖过程中能利用培养基加有14C标记的棕榈酸并代谢产生14CO2到培养基上空气中，14CO2含量增加与否，以确定标本中是否有细菌存在。该系统对快速培养分枝杆菌和药敏试验以及提高提高阳性分离率起到了积极的作用，国内外许多结核病细菌学实验室，已把它作为结核分枝杆菌培养的标准参照系统，但由于该方法培养基内含放射性14C物质和测定时探针的侵入性操作，易造成环境污染和对工作人员造成伤害，目前，一些发达国家和我国的部分城市已禁止使用，此外该系统的配套试剂的供应紧缺也制约了该系统的继续使用。近年来，我国陆续引进了BacT/ALERT 3D全自动培养仪，BacT/ALERT 3D是采用培养全封闭式的比色法原理，通过培养瓶底部一个固相感应器来直接感应培养管内的CO2浓度，感应器从原来蓝绿色变成黄色，其过程由一个置于检测组件内部的反光反射检测计进行连续检测。该仪器每10min监测1次，并通过微机数据处理得出微生物生长曲线。此系统不仅可以解决了放射性污染问题，同时其检测速度也接近被誉为“金标准”的Bactec-460系统。
本组实验研究结果显示：在阳性分离率方面，3D法比L－J法高10.9个百分点，差异有统计学意义(P＜0.05)，与Bactec法相近，差异无统计学意义（P＞0.05）；在分离时间和药敏时间上，3D法比L－J法都缩短9.5d，总计报告时间缩短19d，差异有统计学意义(P＜0.05)，3D法比Bactec法分别延长3.3d和0.5d，总计报告时间延长3.8d，差异无统计学意义(P＞0.05)；在培养污染率方面，3D法与L－J法之间差异无统计学意义（P＞0.05），低于Bactec法2.2个百分点（P＜0.05)，这是由于Bactec系统是用PANTA作为杂菌抑制剂，3D系统所用抗生素补充剂是在PANTA的基础上加有“万古霉素”，此外，Bactec系统在上机检测过程中有探针侵入性穿剌到培养瓶内，而3D系统培养和检测是在全封闭的条件下进行，减少了污染环节。在72例非结核性标本的检测中，3种方法均为阴性结果。这与吴龙章报道［3］Bactec法出现假阳性率为1.3%有异，可能与本组研究例数较少有关；在药敏符合率方面，3D法与L－J法、Bactec法总的符合率分别为94.75%和97.28%，提示可为临床早期化疗提供可靠依据。此外，BacT/ALERT 3D是全自动系统，比半自动的Bactec TB 460系统可减少大量的人工操作，能适应大量样本检测工作。
综上所述，3D法检测分枝杆菌具有阳性分离率高、能缩短报告时间、污染率低，安全可靠，自动化程度高，适合现代化检验医学发展需要，是一种比较理想分枝杆菌快速培养的方法。有条件的实验室，值得推广应用。
【参考文献】
［1］ 齐学进，陈琪福.临床技术操作规范结核病分册［M］.北京：人民军医出版社，2004，32～36.
［2］ 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程［J］.中国防痨杂志，1996，18（1）：28～31.
［3］ 吴龙章，陈素颖，曹务华，等.抗酸性分枝杆菌三种培养方法的对比评价［J］.国际医药卫生导报，2003，9（8）：108～109.
作者单位：广西壮族自治区龙潭医院，广西 柳州 545005； 广西壮族自治区胸科医院,广西 柳州 545005.