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【摘要】 目的 建立抗真菌药固体制剂微生物限度检验方法。 方法 采用平皿法和薄膜过滤法测定样品污染试验菌的回收率来确定适宜的检验方法。 结果 采用平皿法中的培养基稀释法测定样品人工污染3株细菌代表菌株的菌回收率均大于70%，采用薄膜过滤法在冲洗1 000ml时，测定样品人工污染2株真菌代表菌株的菌回收率均大于70%。 结论 可采用平皿法中的培养基稀释法测定抗真菌药片剂中的细菌数，采用薄膜过滤法测定抗真菌药片剂中的霉菌和酵母菌数。
【关键词】 抗真菌药固体制剂 微生物限度检查 验证
Establishment of method for limit test of microbial contamination of anti-fungus medicine solid preparations.
CAI Shan-ying, WANG Kang-jun, ZHANG Yong.
(Hainan Provincial Institute for Drug Inspection, Haikou 570216, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To establish a microbiological test method for Anti- fungus medicine solid preparation. Methods Plate-count methods and membrane filtration methods were used to confirm the suitable test method through determining the bacterial recovery rate. Results The recovery rate of three representative bacteria determined by the culture media dilution method, were more than 70% and the recovery rate of two representative mold and fungus determined by the membrane filtration methods with 1000 ml washed, were more than 70%. Conclusion The total aerobic microbial count of Anti- fungus medicine solid preparation can be determined by the culture media dilution method of Plate-count methods and the total combined molds and yeasts count was determined by membrane filtration methods.
Key words：Anti-fungus medicine solid preparation; Microbial limit tests; Confirmation
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法［1］，各国药典标准均收载［2,3］，分为强制性的和非强制性的限度标准。中国药典2005年版增加方法验证的要求，更有效地确保微生物限度检查方法的可靠性。不同的品种、不同的剂型检查方法可能完全不相同，药典各论项下未收载各品种微生物限度的检验方法，检查方法需进行方法学验证。固体制剂中含有大量的辅料常造成供试样品处理的困难，因此本文选择了克霉唑阴道片和氟康唑片作为代表对抗真菌药固体制剂的微生物限度检查方法进行研究。
1 仪器和材料
1.1 仪器 HYT-2000A智能集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司提供）、生化培养箱。
1.2 材料 供试品：克霉唑阴道片，氟康唑片均为国内厂家生产。试验用菌：大肠埃希菌［CMCC(B) 44102］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B) 63501］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，白色念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉［CMCC(F)98003］均由中国药品生物制品检定所提供。培养基：玫瑰红钠琼脂，营养琼脂，胆盐乳糖培养基，甘露醇氯化钠琼脂，溴化十六烷基三甲铵琼脂均由北京三药科技开发公司提供； MUG，一次性全封闭集菌培养器均由北京牛牛基因技术有限公司提供。
2 实验方法
2.1 菌液制备 分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌在相应温度下培养18～24h的液体培养物1ml，分别加入9ml灭菌生理盐水,10倍稀释至10-5～10-7, 备用。取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物加生理盐水洗下霉菌孢子,吸取出菌液1ml，加入9ml灭菌生理盐水10倍稀释至10-3, 备用。
2.2 供试品的制备 取供试品10g加入100ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，作为1：10的供试液。
2.3 实验方法
2.3.1 细菌数检查方法 常规平皿法、培养基稀释法。
试验组：分别取1：10供试液适量和1ml金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌液加入平皿中，立即倒入15ml琼脂培养基，于30～35℃培养，观察结果。活菌组：测定每一菌株的试验菌数，采用平板菌落计数法。供试品对照组：不加菌液，操作同试验组，测量样品本底菌数。常规平皿法中供试液加入量为1ml，培养基稀释法中供试液加入量为0.2ml，结果见表1。
表1 人工染菌的回收率结果（略）
2.3.2 霉菌和酵母菌数检查方法 薄膜过滤法
试验组：取1：10供试液1ml薄膜过滤，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml 白色念珠菌、黑曲霉菌菌液，过滤取出滤膜，分别贴于玫瑰红钠琼脂平皿中于24～28℃培养,观察结果。活菌组：测定每一菌株的试验菌数，采用平板菌落计数法。供试品对照组：不加菌液，操作同试验组，测量样品本底菌数。稀释剂对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为供试液，操作同试验组，结果见表2。
表2 薄膜过滤法测定人工染菌回收率结果（略）
2.3.3 控制菌检查方法
2.3.3.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 中国药典2005年版中常规法
试验组：取克霉唑阴道片1：10供试液10ml和相应试验菌，加入100ml相应的增菌培养基中，依中国药典2005年版中相应控制菌检查法进行试验。阴性对照组：取1：10供试液10ml和1ml大肠埃希菌液，操作同试验组。金黄色葡萄球菌：取上述培养物划于甘露醇氯化钠琼脂平板上，培养24h观察结果，取上述培养物各划线接种至十六烷基三甲铵琼脂平板上，(36±1)℃培养24h；铜绿假单胞菌：取培养物进行氧化酶试验和革兰氏染色试验，结果见表3。
表3 控制菌检查方法验证结果实验（略）
2.3.3.2 大肠埃希菌 中国药典2005年版微生物限度检查中的常规法
试验组：取氟康唑片1：10供试液10ml和相应试验菌，加入100ml相应的增菌培养基中，依中国药典2005年版中相应控制菌检查法进行试验。阴性对照组：取1：10供试液10ml和1ml金黄色葡萄球菌液，操作同试验组。 取上述培养物各0.2ml接种至5ml MUG培养基试管内，于36±1℃培养，5h、24h在365nm的紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照，结果见表4。
3 结果与讨论
从上述结果可知，采用常规平皿法测定细菌数，人工污染3株代表菌株,克霉唑阴道片试验组的菌回收率均低于70%，未能达到微生物限度方法验证的要求；采用培养基稀释法测定细菌数，克霉唑阴道片和氟康唑片试验组的菌回收率均大于70%，可满足方法验证的要求，表明检查方法可行。采用薄膜过滤法测定霉菌和酵母菌数，人工污染2株代表菌株，冲洗量为300ml和600ml时，试验组的菌回收率均低于70%，不满足方法验证的要求； 当冲洗量为1 000ml时，试验组和稀释对照组的菌回收率均高于70%，满足方法验证的要求。
表4 大肠埃希菌检查方法验证结果（略）
中国药典2005年版微生物限度中控制菌是根据给药途径进行控制的。克霉唑阴道片为阴道用药，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为其控制菌，氟康唑片为口服制剂，大肠埃希菌为其控制菌。从结果可知，采用控制菌检查法中的常规法，控制菌的试验组均为阳性，阴性对照组均为阴性结果，可满足方法学验证要求。
进行微生物限度试验时，首先要选择样品处理的方法，方法的选择要根据药品的抗菌特性和辅料的情况，尤其是要考虑不溶性的药物和辅料。抗真菌药一般对革兰氏菌无抑制作用，在进行细菌和控制菌检验时，可采用常规法或培养基稀释法进行，对于霉菌和酵母菌数的测定则需消除样品的抑菌作用，一般采用薄膜过滤法。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部） ［M］.北京：化学工业出版社，2005,附录:93～101.
［2］ United States Pharmacopeial Convention.Inc. USP 30,NF 25［M］.Washington DC:The Board of Trustees,2007,83～88.
［3］ British Pharmacopoeia Commission Office. BP2007［M］. London:The Stationery Office, 2007, Appendix XIV B 373～386.
作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216.