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【摘要】 目的 探讨超氧化物歧化酶（SOD）高产酵母菌株Yb0101发酵条件，分析培养温度、装液量、时间、氮源类型对其产酶的影响。 方法 对培养温度、装液量、时间和氮源等因子均设置不同水平，通过比较各因素不同水平时发酵液中的SOD活力，确定最佳发酵条件。 结果 温度30℃，装液量40ml、发酵时间21h发酵后所得的粗酶液SOD活力最高。尿素浓度0.2%、0.4%时，以及硫酸铵浓度0.2%时，SOD活力均增加，但生物量均减少。 结论 适宜条件下，Yb0101产生SOD活力最高。
【关键词】 超氧化物歧化酶 SOD 发酵 酵母菌株
Study on the fermention conditions of superoxide dismutase(SOD) producing strain Yb0101.
YANG Xin-feng, TANG Xiang-feng, CHEN Bi-hong, et al.
(College of Technology, South China University of Tropical Agriculture, Danzhou 571737, Hainan , P. R. China)
Abstract：Objective To discuss the fermenting conditions including temperature, liquid volume ,culture time and nitrogen resource on enzyme production by superoxide dismutase(SOD) producing strain Yb0101. Methods Every factor including temperature, liquid volume ,culture time and nitrogen resource was set to different levels, SOD activity of different factor and levels was compared and the most suitable condictions were determined. Results SOD activity of fermenting liqulid was highest at 30℃ , 21 hours after culture with liquid volume 40mL. When 0.2%，0.4% Urea or 0.2% (NH4)2SO4 was added, SOD activity was increased, but the biomass was declined. Conclusion SOD activity produced by the strain Yb0101was highest when the culture conditions were suitable.
Key words：Superoxide dismutase(SOD)；Fermention; Strain
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一种对机体具有显著保护作用的生物酶，广泛分布于动物﹑植物与微生物内。SOD主要应用于医药食品和化妆品工业，作为抗衰老、抗炎症、治疗自身免疫疾病的药品以及食品、化妆品的添加剂［1,2］。目前，SOD的生产主要是从动物血液或肝脏中提取，资源有限而且容易造成污染。因此目前研究人员把研究热点放在微生物发酵法制取SOD上［3～5］。本文研究的是酵母菌株Yb0101产SOD的发酵条件，经试验与分析，得到了最适发酵条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 Yb0101为实验室前期筛选获得，经鉴定为酵母菌。
1.1.2 试剂 SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）提供。
1.1.3 培养基 发酵培养基：葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母膏5g，KH2PO4 5g，MgSO4.7H2O 2g,加水至1 000ml；菌种保藏培养基：上述发酵培养基中加琼脂1.5%，制得固体培养基，用于菌种保藏。
1.2 主要仪器 722型分光光度计（上海第三分析仪器厂），PB 3002-N电子精密天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），GZO25型全自动种子发芽箱（南京实验仪器厂），ZD-88-B大容量恒温振荡器（太仓市博莱特实验仪器厂）。
1.3 菌种活化、扩大培养及发酵 挑取Yb0101划线法接种至平板培养基，28℃培养24h，再从培养皿中挑取较大而典型的单菌落接种至固体斜面，28℃培养24h，备用。
挑取上述活化后的斜面培养物一环，接种入装有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，28℃摇床培养18h。再按10％接种量（V/V）接种至液体发酵培养基中，摇床转速为150r/min。改变液体培养基的条件，包括温度（24℃、27℃、30℃、33℃）、培养时间（15h、18h、21h、24h）、装液量（30ml、40ml、50ml、60ml）、氮源类型（硫酸铵、尿素），培养结束后，离心，收集菌体，测量菌体生物量和SOD活性。
1.4 菌体生物量（湿菌体重）测定方法 按文献方法［6,7］进行，将发酵液转入离心管（已称重），以4 000r/min离心15min,弃上清液，称重，两次质量差值即为湿菌体重（g）。
1.5 SOD的提取（SOD粗酶液的制备） 按文献方法［6,7］进行，将研钵置冰浴中，用0.05mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液将湿菌体全部转入研钵中，加入0.5g石英砂，研磨10min，再加入10ml 0.05mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液，4℃抽提4h，4 000r/min离心30min。上清液为SOD粗酶液。
1.6 SOD活力测定 按SOD试剂盒说明书操作。计算公式：SOD活力（U/100mL）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度÷50%×样本测试前的稀释倍数×反应体系的稀释倍数×100
2 结果
2.1 培养温度对产酶的影响 结果表明，在4个温度中，27℃时生物量最高；30℃和33℃时每100mL发酵液中SOD活力差别不大且均高于27℃、24℃。见图1～2。
图1 菌株Yb0101在不同温度下的生物量（略）
Fig 1 Biomass of strain Yb0101 at different temperature
图2 菌株Yb0101在不同温度下的SOD活力（略）
Fig 2 SOD activity of strain Yb0101 at different temperature
2.2 装液量对产酶的影响 在4个体积中，60ml液量时生物量最高；但随装液量增加，SOD活力降低，装液量30ml时SOD活力最高，而且30ml和40ml时SOD活力差别不大。见图3、4。
图3 菌株Yb0101在不同装液量的生物量（略）
Fig 3 Biomass of strain Yb0101 at different volume
图4 菌株Yb0101在不同装液量的SOD活力（略）
Fig 4 SOD activity of strain Yb0101 at different volume
2.3 培养时间对产酶的影响 图5表明，在4个培养时间中，培养24h生物量最高。图6表明，在4个培养时间中，培养21h SOD活力最高。确定菌株Yb0101最佳培养时间为21h。
图5 菌株Yb0101在不同培养时间的生物量（略）
Fig 5 Biomass of strain Yb0101 at different cuiture time
图6 菌株Yb0101在不同培养时间的SOD活力（略）
Fig 6 SOD activity of strain Yb0101 at different cuiture time
2.4 发酵培养基氮源类型对菌株Yb0101产酶的影响 表1表明，尿素浓度0.2%、0.4%时，以及硫酸铵浓度0.2%时，生物量均减少，但SOD活力均增加，其中添加0.4％尿素后菌株所产酶的活力最高。
表1 氮源类型对菌株Yb0101产酶的生长影响（略）
Table 1 Effects of nitrogen resource to SOD activity of strain Yb0101
注：表中“-”表示生物量极少，没有进一步检测。表中结果均为三次重复的平均值。
3 讨论
温度对产酶的影响中，27℃时生物量最高，30℃和33℃时生物量低于27℃但SOD活力均高于27℃，说明利于Yb0101生物量积累的温度与产酶最适温度不一致。由于生产中更有价值的是酶的性质，因此确定30℃是菌株Yb0101的最佳产酶温度。
在培养时间对产酶的影响中，生物量积累最高的时间与产酶最高的时间不一致，这与苏昕等的研究结果相同［8］。
在发酵液对产酶影响中，60ml液量时生物量最高，但随装液量增加，SOD活力降低，原因可能是，发酵液装量多，则菌株可以获得更多养分来增加生物量；但SOD是需氧生物胞内清除活性氧的酶，装液量少，供氧量多，产酶也多。考虑到发酵容器的利用率，确定菌株Yb0101的最佳装液量为250ml三角瓶装40ml。
蛋白胨是微生物培养时常用的优质氮源，但价格较高，因此试验中尝试用尿素、硫酸铵等廉价氮源代替胰蛋白胨。结果表明用廉价的氮源来代替蛋白胨是可行的。另外，尿素浓度0.6%、0.8%时，以及硫酸铵浓度0.4%、0.6%、0.8%时菌体的生长繁殖受到了抑制，因此浓度须适当。
菌株Yb0101摇瓶培养产SOD的适宜条件为：培养温度30℃，装液量40ml/250ml三角瓶，培养时间21h。尿素浓度0.2%、0.4%时，以及硫酸铵浓度0.2%时，生物量均减少，但SOD活力均增加。
【参考文献】
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作者单位：华南热带农业大学 理工学院,海南 儋州 571737.