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【摘要】 目的 研究方格星虫多糖的抗菌活性。 方法 以方格星虫体壁作为试验材料,经沸水抽提、乙醇沉淀和sevage法去蛋白后得到粗多糖,再经G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化。采用硫酸-苯酚法测定多糖的含量,以含不同浓度的方格星虫多糖(50,37.5,25,12.5mg/ml)培养基,分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草杆菌培养12、24、36、48h,观察并记录其生长情况。 结果 不同方格星虫多糖浓度(25~50mg/ml)对三种试验菌的生长均有抑制作用,浓度越高抗菌活性越强。 结论 方格星虫多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌埃希菌、枯草杆菌有明显的抗菌活性。
【关键词】 方格星虫 多糖 抗菌活性
Preliminary observation on the antibacterial activity on polysaccharides in Sipunculus nudus.
XIA Qian-feng,TAN He-lin, QIN Xi, et al.
(The department of laboratory medicine, Hainan Medical College, Haikou 570102,Hainan; Institute of genetics and developmental biology Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, P. R. China)
Abstract:Objective To explore the antibacterial activity of polysaccharides contained in Sipunculus nudus. Methods The polysaccharides contained in body wall of Sipunculus nudus were obtained.Crude polysaccharides were isolated by water boiling, ethanol precipitation and sevage method. Then they were purified bySephadex- G-50 chromatography. The concentration of polysaccharide was detectedby sulphuric acid phenol method. Staphylococcus aureus, escherichia coli and bacillus subtilis were exposed to different concentrations of 50, 37.5, 25l, 12.5mg/ml of polysaccharides contained in Sipunculus nudus for 12、24、36、48 hour srespectively . The inhibitory effects was observed on the nutrient medium. Results Three bacteria were restrained by different concentrations of polysaccharides contained in Sipunculus nudus, the antibacterial activity was increased in dose-dependent ways by polysaccharides contained in Sipunculus nudus. Conclusion Polysaccharides contained in Sipunculus shows significant antibacterial activity on Staphylococcus aureus, escherichia coli and bacillus subtilis.
Key words:Sipunculus nudus; Polysaccharide; Antibacterial activity
方格星虫(Sipunculus nudus)为星虫动物门星虫科方格星虫属动物,通常生活在沿海滩涂一带沙泥底质的海域,涨潮时钻出,退潮时潜伏在沙泥中,故俗称沙虫。现代医药研究表明星虫含有多种活性物质,能够调节机体多种机能,含有丰富的蛋白质、微量元素、多糖等[1,2]。目前国内对方格星虫主要研究其繁殖生物学以及人工养殖技术[3];国外对其代谢生理、生态特征等进行研究[4,5],对其多糖抗菌活性的研究国内外均未见报道。多糖作为天然大分子物质同核酸、蛋白质一样是所有生命有机体的重要组成部分,在高等动物、植物、藻类以及菌类中均有存在,是自然界含量最丰富的生物聚合物,与维持生命所需的多种生理功能密切相关。随着生物化学研究飞速发展,对多糖及其复合物的化学结构和生物活性的研究也越来越深入。笔者对方格星虫多糖抗菌活性进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 褐色方格星虫(采于海口市),供试菌:金黄色葡萄球菌菌(ATCC6538)、大肠埃希菌(标44155)、枯草杆菌(标63501),购自北京生物制品鉴定所。
1.1.2 培养基的制备 取50ml已知浓度多糖溶液,加入蛋白胨0.5g、NaCl 0.5g、酵母浸膏0.25g及琼脂粉0.9g,加入20ml蒸馏水,高压灭菌,分别配制成含50、37.5、25、12.5mg/ml多糖的培养基。
1.2 方法
1.2.1 方格星虫多糖的提取 将样品干燥至恒重研磨后,用无水乙醇浸泡12h,再将样品用超纯水煮沸3h,过滤,残渣继续煮沸2h和1h,分别过滤,三次滤液分别离心取其上清液。去蛋白后,试液在不断搅拌下,缓慢加入无水乙醇,4℃静止至上清液不再浑浊,离心收集沉淀,沉淀经75℃烘干后得粗多糖。
1.2.2 样品多糖的纯化 将样品多糖配成水溶液,加入Sevage液(三氯甲烷:正丁醇=4:1)(v/v),充分振荡后静置5h以上用低速离心机离心保留水相,反复除蛋白直至无蛋白层。提取液经G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化。
1.2.3 多糖纯度的鉴定 用0.06mol/L巴比妥缓冲液(pH8.6)配制成1%琼脂糖溶液制板,加样并电泳,电泳结束后用5%甲苯胺蓝溶液染色15min,用1%醋酸溶液洗脱,背景无颜色即为合格多糖。
1.2.4 样品多糖含量的测定 精密称取100℃干燥至恒重的对照葡萄糖508.5mg,加水溶解,定容于200ml容量瓶中,配制成2.5425mg/ml的葡萄糖对照溶液备用。精密吸取稀释5倍的葡萄糖对照溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于20ml的干燥试管中,依次加水使体积均为1.0ml,再分别加入5%苯酚2.0ml,摇匀,迅速滴加浓硫酸3.0ml,充分摇匀,水浴加热15min,在490nm处测其吸光度值。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,同时测定多糖溶液吸光度,参照标准曲线获得多糖浓度。
1.2.5 涂布法抗菌活性测定 将褐色方格星虫肉体提取物多糖用无菌水溶解,分别配成多糖含量为50mg/ml、37.5mg/ml、25mg/ml和12.5mg/ml的稀释液,再以此溶液配成营养培养基,取配好的菌悬液(麦氏浊度0.5)0.6ml接种于相应的培养基上均匀涂布,37℃培养,每隔12h观察1次。
1.2.6 滴注法抗菌活性测定 不同浓度的多糖培养基的制备同涂布法。吸取上述菌悬液0.2 ml滴种在培养基上,每个培养皿滴3滴(呈三角形),37℃培养,每隔12h观察1次。
2 结果
2.1 涂布法结果见表1。
2.2 滴注法结果见表2。
表1 涂布法测定方格星虫多糖对三种供试菌的抗菌活性多糖浓度(略)
注:-.未见细菌生长;+.有细菌生长;以上结果为5次重复接种试验结果。
表2 滴注法测定方格星虫多糖对三种供试菌的抗菌活性多糖浓度(略)
注:-.未见细菌生长;+.有细菌生长;以上结果为5次重复接种试验结果。
3 讨论
星虫动物属于海生、闭管式循环的体腔动物,广泛分布于三大洋中,除幼虫期外,皆喜在海底生活。多数栖息在热带和亚热带浅海泥沙内和珊瑚间[6]。沙虫肌肉发达但身体结构简单,全条都可食用和药用。沙虫不仅肉质脆嫩、味道鲜美,而且营养丰富,富含蛋白质和钙、磷、铁、多种微量元素成份;其药用价值较高,有“冬虫夏草”之称。据记载,沙虫性寒、味甘、咸,具有滋阴降火、清肺补虚及补肾养颜等功能,可治疗骨蒸潮热、阴虚盗汗、肺虚喘咳、胸闷痰多以及妇女产后乳汁稀少等症,对治疗肝炎、肺痨咳嗽、神经衰弱、小儿脾虚与肾亏而夜尿频繁等症均有效果[1]。对沙虫药用价值的研究国外尚未见报道,国内黄哲元对星虫制成品—土蒜冻进行了有关生物活性小分子的鉴定和药学研究, 主要分离鉴定了游离氨基酸和牛黄酸,证实小分子牛黄酸对病毒性肝炎有治疗效果,游离氨基酸对乙肝病毒不具有抗性[7]。而对星虫多糖的生物活性研究资料缺乏。
本研究结果显示,方格星虫提取物多糖具有抗菌活性,不同浓度对三种供试菌有不同程度抑制作用,浓度越高,抑制作用越强。浓度为50mg/ml对以上三种细菌生长的抑制作用最显著,且对大肠埃希菌的作用要强于对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的作用。多糖对细菌的抑制作用还与接种的方法有关。在本实验中,用涂布法接种的抗菌作用要强于用滴注法接种的,可能为滴注法对培养基中的多糖有一定的稀释作用所致。从方格星虫体内提取的多糖具有抗菌活性,但对多糖抗菌具体机制还有待进一步研究。
【参考文献】
[1] 中国人民解放军海军后勤部卫生部等编 .中国药用海洋生物[M].上海:上海人民出版社 ,19 77.37
[2] 张桂和,赵谋明,王炜.方格星虫多糖分离纯化及性质鉴定[J].食品与生物技术学报,2006,25(4):63~66.
[3] 兰国宝,同冰,廖思明.方格星虫胚胎与幼体发育的研究[J].热带海洋学报,2003,22(6):70~75
[4] Curler E B,Dean H K,Saiz-Salinas J I.Sipuncula from Antarctic waters[J].Proceeding of the Biological Society of Washington,2001,114(4):861~880.
[5] Lunetta D G,Farina E,Manione R. Sipuculus nudus:particulate components of the coelomic fluid and its relationship with brown bodies[J].Iatl J Zool,2004,71(3):191~199.
[6] 相建海.海洋生物学[M].北京:科学出版社,2003,74~75.
[7] 黄哲元 .星虫 phascolosama制成品—土蒜冻的药学研究[J].中国海洋药物,1990,9( 3):52~54.
作者单位:海南医学院检验医学系,海南 海口 570102; 中国科学院遗传与发育生物研究所,北京 100101.