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【摘要】 目的 探讨肺耐药蛋白（Lung resistance protein,LRP）,多药耐药蛋白（Multidrug resistance－associated protein,MRP）和多药耐药基因（Multidrug resistance,MDR1）的mRNA在非小细胞肺癌（Non－small cell cancer,NSCLC）中共表达及临床意义。 方法 RT－PCR检测NSCLC冰冻组织中上述耐药基因的mRNA水平。 结果 LRP、MRP、 MDR1mRNA阳性率分别为71.2%、81.8%和37.9%；MRP与、 MDR1、MRP与LRP、LRPYU MDR1及MRP、LRPYU MDR1共表达者分别为16.7%（11/66）、53.0%（35/66）、19.7%（13/66）及12.1%（8/66）。LRP与MRP阳性相关（r=0.47,p=0.001）,LRP、MRP与 MDR1无相关性（r=0.98,p=0.077;r=0.25,p=0.053）.3种耐药基因表达在NSCLC各期、各分化组中差异无显著性（P≥0.05）。肺腺癌换了有效组LRP、MRPmRNA（0.53±0.08;0.41±0.01）及鳞癌化疗有效组LRPmRNA表达（0.42±0.03）明显低于换了无效组（1.14±0.3，0.82±0.04，0.97±0.01，P<0.05）；LRP与MRP、LRP、MRP与 MDR1共表达者，中位生存期明显缩短（P<0.05）。多变量Cox回归分析，仅LRP+MRP、LRP+MRP+MDR1共表达有预后意义。 结论 非小细胞肺癌原发耐药与LRP、MRP、 MDR1共同作用有关。
【关键词】 癌；非小细胞；肺；LRP基因；MRP基因； MDR1基因；基因表达
The expression of LRP，MRP and MDR1 in non－small－cell lung cancer and their clinical significance.
WANG Yan, ZHANG Ting
Jilin Municipal Central Hospital, Jilin 132001, Jilin, P. R. China
Abstract：Objective To determine the expression of lung resistance protein（LRP）,multidrug resistance-associated protein（MRP）and multidrug resistance 1(MDR1mrna ),and discuss its clinical significance in non-small-cell lung cancer(NSCLC). Methods RT-RCR was used to determine the expression of mrna of the above mentioned genes. Results The frequency of expression of LRP,MRP and MDR was 74.2%,80.3% and 37.9% ,respectively. A significant positive correlation was observed between LRP and MRP（r=0.47;P=0.001）,but this correlation was found neither between LRP and MDR1,nor between MRP and MDR. The expression of LRP,MRP and MDR1 did not vary with the grade of cell differentiation and TNM staging. In adenocarcinomas which responded to chemotherapy,there was lowered expression of both LRP and MRP than those which did not respond. In chemotherapy aquamous-cell carcinomas,however,this was true of LRP expression only.The median survival time of NSCLC patients with co-expressed 2 and 3 drug resistance related genes was significantly redusced. Conclusion The intrinsic multidrug resistance of NSCLC involves the combined effects of LRP,MRP and MDR.
Key words：Carcinoma; Non-small cell lung;LRP gene;MDR gene;Expression
肺耐药蛋白（Lung resistance protein,LRP）肿瘤基因、多药耐药蛋白（Multidrug resistance-associated protein,MRP）基因是近年发现的肿瘤耐药相关基因，其所编码的耐药蛋白分别通过核耙点的屏障机制，以及泵出GS-X复合物，参与胞质囊泡运输介导耐药。LRP、MRP 在卵巢癌，乳腺癌等肿瘤中表达明显高于多药耐药基因（Multidrug resistance,MDR）,但对其共表达在非小细胞肺癌（Non-small cell cancer,NSCLC）中的预后意义 却知之甚少。我们应用RT-PCR 技术，探讨3种耐药基因LRP，MRP，MDRmRNA 在NSCLC冰冻组织种的表达及与分期，疗效的关系。
1 资料与方法
1.１ 临床资料
66例NSCLC组织均取自我院2000年10月～2005年10月活检或外科手术切除标本，所有标本部分送病理，余均送细胞室存于液氮中备用。患者中女性21例，男性45例；中位年龄57.2岁。腺癌35例，鳞癌3１例。分化程度一级21例，二级26例，三级19例。TNM分期；Ⅰa期5例，Ⅱa期 6例，Ⅱb期9例，Ⅲa期8例，Ⅲb期14例，Ⅳ期24例。所有患者术后或活检后均接收至少3周期化疗，疗效根据WHO标准确定，达完全缓解或部分缓解者为疗效有效，稳定或进展者为疗效无效。其中13例未做疗效评价，22例化疗有效，31例无效。本组中56例有完整随访资料，生存期计算自化疗或手术首日始至死亡或失访日止。中数随访月34个月，39例死亡。5例癌旁组织作对照。
1.2 方法
RNA提取及RT-PCR；分别取约50mg液氮冻存组织于乳钵中，在-20℃低温霞迅速磨成粉末并移入5ml离心管，Trizol 试剂盒提取RNA。测吸光度值（A值，曾称光密度OD值）定量并电泳。逆转录反应体系25μl ，其中含1.5μl RNA模板，3.0μl逆转录缓冲液，2.5μl随机引物(Gibco),1.5U Rnase抑制剂（Gibco），1μl dNTP（Sigma）,15U逆转录酶（Sigma），42℃1h后，75℃10min，产物行PCR扩增，以β-actinDNA为内参照，各靶基因引物及退火温度见表1.预变性94℃ 5min后，变性94℃ 30s，延伸72℃ 1min，29～30个循环，最后72℃充分延伸10min，取10μl 1.8％琼脂糖电泳，扩增产物辉度扫描，靶基因A值/β-actinA值即为靶基因mRNA相对量。表1 靶基因引物序列及PCR反应条件（略）
１.3 统计学分析
stata软件包上进行数据处理，Fisher`s exact 检验分析MRP、LRP、MDR1 阳性与病理分期、分化程度、疗效关系，spernman秩相关比较3种基因的相关性。Kaplan-merier曲线法与Long-rank检验做生存时间分析，多变量Cox回归分析患者病理特点及3种耐药基因对总生存期的影响。
２ 结果
２.１ NSCLC LRP、MRP、MDR1 mRNA表达及相关性
RT-PCR检测，NSCLC MRP、LRP、MDR1mRNA阳性率分别为71.2%（47/66）、81.8%（54/66）和37.9%（25/66），MRP与MDR1、MRP与LRP、LRP与MDR1及MRP、LRP与MDR1 同时阳性者分别为16.7%（11/66）、53.0%（35/66）、19.7%（13/66）和12.1%（8/66）。LRP与MRP具相关性（r=0.47,P=0.001）,LRP、MRP与 MDR1无相关性（r=0.98,P=0.077; r=0.25,P=0.053）。5例癌旁组织仅1例MRP阳性。
２.２ LRP、MRP、MDR1 mRNA表达与分期、分化程度
NSCLC各期LRP、MRP、MDR1 mRNA水平相近（P>0.05），分化程度Ⅲ级者 MRP、LRP mRNA表达高于Ⅰ、Ⅱ级，MDR1 mRNA表达则低于Ⅱ级，高于Ⅰ级，差异均无显著性（P>0.05 表2）。表2 分化程度与LRP、MRP、MDR1 mRNA表达的关系分化（略）
２.３ LRP、MRP、MDR1 mRNA表达与疗效
肺腺癌化疗有效组LRP、MRP mRNA表达水平（0.53±0.08，0.41±0.01）明显低于化疗无效组（1.14±0.30，0.82±0.04：P=0.023）；鳞癌化疗有效组LRP mRNA表达（0.42±0.03）低于无效组（0.97±0.01，P=0.001），MRP mRNA表达（0.65±0.04）略高于无效组（0.41±0.06，P=0.228）；腺癌与鳞癌化疗有效与无效组MDR1 mRNA表达水平相近（P>0.05，表3）。表3 NSCLC化疗疗效与耐药相关基因mRNA表达水平（略）
２.４ LRP、MRP、MDR1 表达与中位生存期
LRP、MRP、MDR1 阳性者中位生存期（9.2，8.5及10.5个月）接近3者阴性表达者（13.5个月，P>0.05），LRP与MDR1 ，MRP与MDR1 共表达者中位生存期分别为10.4个月、12.5个月，较之阴性表达者无统计学意义（P=0.072，P=0.130）；LRP、MRP、MRP与MDR1共表达者中位生存期明显缩短（5.5个月：11.8个月，P=0.01；6.5个月：13.5个月，P=0.02）。多变量Cox回归分析，肿瘤分析、分化程度及LRP、MRP、MDR1 均非独立的预后因素；以2-3种耐药基因共表达作为参数进行Cox分析，发现RP+MRP或LRP+MRP+MDR1 共表达有预后意义（危险度、95%可信区间、P值分别为：36.21，10.34—18.11，0.001；17.18，7.33—11.25，0.013）。
此外，3例NSCLC有化疗前后标本，其中一例疗前MRP表达，疗后MRP表达增强，且LRP、MDR1 由阴性转为阳性疗效评定治疗无效；另两例LRP、MRP疗后表达明显增强，治疗无效。因病例少，未做统计学分析。
３ 讨论
MDR1/P-gp介导的MDR是目前研究最广泛深入的机制，其过度表达因增加药物外流，降低胞内药物浓度导致耐药，但临床检测至少1/3急性髓性白血病患者无MDR1 /P-gp表达，NSCLC、乳腺癌等实体瘤MDR1 /P-gp阳性率亦徘徊于30%左右，提示存在其他更为重要的耐药机制［1］。MRP与LRP系近年克隆的新耐药相关基因，MRP蛋白与MDR1 /P-gp同属ABC超家族膜转阴蛋白，主要通过转运GS-X复合物及胞质囊泡运输介导ADM、VCR等的耐药；LRP蛋白则是穹隆蛋白的主要成分，起过度表达明显影响药物的胞内转运与分布，致靶点药物有效浓度下降而介导铂类、烷化剂等耐药。正如肿瘤发生要经历多基因、多阶段作用，肿瘤耐药亦是多因素参与的过程［2,3］。单纯以某以耐药基因为靶探讨其临床意义，势必以偏概全。本组66例 疗前NSCLC有不同程度LRP、MRP、MDR1 共表达，支持肿瘤耐药的多基因学说。LRP、MRP mRNA表达水平明显高于MDR1 mRNA，仅MRP、LRP与耐药相关，提示LRP、MRP而非MDR1 作为NSCLC原发耐药的指标，将可能指导临床化疗药物的筛选及化疗方向的优化。
Eid等分析77例睾丸细胞癌MDR1 /P-gp、p53及MT蛋白表达与病理分期关系，发现晚期患者MDR1 高表达，且预后较差，可能因MDR1 不仅介导耐药，亦与生物学恶性表型有关［4］。本组以癌组织分化程度、TNM分期为基础，比较各亚组间LRP、MRP、MDR1 的表达，未发现组间差异有显著性。因此进行肿瘤耐药的检测与评价，进而寻找有效、特异的 耐药逆转剂，不仅利于首先化疗的晚期患者，对早期术前、术后化疗亦具一定的意义。
MRP与LRP具相关性。而LRP与MDR1 、MRP与MDR1间未发现此种相关性。可能是MDR1 低表达之故。进一步分析 LRP、MRP、MDR1 与预后的关系，发现三者作为独立因素均无预后意义；以2-3种耐药基因共表达为参数，结果表明LRP+MRP、LRP+MRP+MDR1 共表达与预后相关，此结果接近Izquierdo等对61株非药物选择性肿瘤细胞多耐药基因表达与耐药相关性的研究［5］。尽管本组例数少，难以定论，但亦可初步证实NSCLC耐药系多因素参与。
【参考文献】
［1］Loe DW, Deeley RG,Cole SPC.Biology of the multidrug resistance-saaociated protein,MRP［J］. Eur J Cancer,1996,32A:945～957.
［2］Lyttelton MPA,Hart S, Ganeshaguyru K,et al .Quantitation of multidrug resistant MDR1 transcript in acute myeloid leukemia by non-isotopic quantitativecDNA-polymerase chain reaction［J］. Br J Haematol,1994,86:879～883.
［3］Lehnert M.Clinical multidrug resistance in cancer: a multifactorial problem［J］. Eur J cancer, 1996,32A:912～920.
［4］Eid H,Geczi L,Magori A, et al.Drug resistance and sensitivity of germ cell testicular tumors: evaluation of clinical relevance of MDR1/P-gp, p53, and metallothionein(MT) proterns［J］.Anticancer Res,1998,18:3059～3064.
［5］Izquierdo MA,Shoemarker SF.Overlapping of the multidrug resistance among panels of human cancer lines［J］.Int J Cancer,1996,65:230～235.
作者单位：吉林市中心医院,吉林 吉林 132011.