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首页医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2008年第8卷第1期

猴耳环水提取物抗流感病毒的实验研究

来源:中国热带医学
摘要:【摘要】目的研究猴耳环水提取物体内外抗流感病毒的活性。方法体外抗病毒试验采用CPE法,按Reed-Muench方法计算TC50、IC50和TI,观察猴耳环水提取物体外对流感病毒引起的细胞病变的影响和在体内采用小鼠经滴鼻感染流感病毒造成肺炎模型,以肺部炎症、死亡率和生命延长率为指标,观察猴耳环水提取物体内抗流感病......

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【摘要】    目的 研究猴耳环水提取物体内外流感病毒的活性。方法 体外抗病毒试验采用CPE法,按Reed-Muench方法计算TC50、IC50 和TI,观察猴耳环水提取物体外对流感病毒引起的细胞病变的影响和在体内采用小鼠经滴鼻感染流感病毒造成肺炎模型,以肺部炎症、死亡率和生命延长率为指标,观察猴耳环水提取物体内抗流感病毒的活性。结果 猴耳环水提取物在体外对流感病毒引起的细胞病变有明显抑制作用,其IC50生药为3.33mg/ml,TI为7.48;在给生药药剂量为8~20g/kg时,对流感病毒所致的小鼠肺部炎症有明显抑制作用,并能明显降低流感病毒感染小鼠的死亡率和延长其存活时间。结论 猴耳环水提取物在体内外均具有明显抗流感病毒的作用。

【关键词】  猴耳环;水提取物;抗流感病毒

  Experimental study on anti-viral activity of the water extract from Pitecollobium clypearia Benth.

  ZHANG Zhong-xian, HUANG Jian-zhen, LI Pei-bo
  (1.Hunan Provincial Second People's Hospital. Changsha 410004, Hunan,P. R. China; 2.College of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Guangdong, P. R. China)
   
  Abstract:Objective  To examine the in vitro and in vivo antiviral activity of water extract from Pitecollobium clypearia Benth.  Methods  The antiviral effect of extract from Pitecollobium clypearia Benth was assessed by determination of the reduction of cytopathic effect (CPE), the 50% toxicity concentration (TC50), 50% inhibitor concentration (IC50), and the therapeutic index (TI) of the water extract from Pitecollobium clypearia Benth.The results of lung inflammation, mortality rate and the survival rate of mice infected by influenza virus were observed.  Results  The cytopathic effect induced by influenza virus was inhibited remarkedly,with IC50 of 3.33 mg raw material/ml and TI of 7.48. At the dose of 8~20g raw material/kg body weight,pneumonia induced by influenza virus in mice was inhibited significantly by the water extract.The survival rate was increased remarkedly.  Conclusion  The water extract from Pitecollobium clypearia Benth. Exhibits apparent anti-influenza activity both in vitro and in vivo.

    Key words:Pitecollobium clypearia Benth;Water extract;Anti-influenza virus

    猴耳环(Pitecollobium clypearia Benth.)又名围延树、蛟龙木落地金钱、鸡三树、尿桶公等,是豆科植物亮叶围延树的枝叶,分布于浙江、福建、广东、广西、四川、云南等省区,具有清热解毒,凉血消肿等功效[1]。现代临床上用于上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃体炎急性胃肠炎等症。其单方制剂猴耳环消炎片作为抗炎及呼吸道疾病用药已得到广泛的应用,其处方为猴耳环嫩枝叶的水提浸膏[2]。目前,关于猴耳环的现代药理研究报道很少,仅见Li YL等发现猴耳环水提物对呼吸道合胞病毒(RSV)有体外抑制作用,且发现其化学成分槲皮素具有抗呼吸道合胞病毒作用[3,4]。但尚未见有关猴耳环对流感病毒作用的研究报道。因此,作者对猴耳环水提取物进行抗流感病毒作用的体内和体外实验研究,现报告如下。

  1  材料与方法

  1.1 药物及试剂 

  猴耳环水提取物(采用水煎法自制,方法为:取适量猴耳环,粉碎,每次用8倍量水煎煮1 h,共2次,合并2次水煎煮液,浓缩,滤膜除菌, 4℃冰箱保存备用);病毒唑:浙江亚太药业股份有限公司生产,批号:060301。

  1.2 动物 

  昆明种小鼠,雌雄各半,体重20~24g,SPF级,由广东省医学实验动物中心提供,动物合格证号:粤监证字2006A018。

  1.3 病毒株及细胞 

  甲型流感病毒、流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1),购自中国预防医学科学院病毒学研究所;MDCK细胞株,购自中山大学实验动物中心细胞室。

  1.4 细胞培养液和维持液 

  细胞培养液为含100U/ml的青霉素、100μg/ml 的链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液;细胞维持液除含2%胎牛血清外,其他成分同培养液。

  1.5  方法

  1.5.1 猴耳环水提取物在体外对MDCK培养细胞的毒性试验[5] 

  将猴耳环水提取物母液用细胞培养液做等比稀释后,加到已长成单层的MDCK细胞培养板中,100μl/孔,每个稀释度药液做4个复孔,同时设正常细胞对照、病毒对照和病毒唑对照。将培养板置37℃ 5% CO2培养箱中培养4d,每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况。按Reed-Muench[6]法计算半数细胞毒性浓度( TC50)。

  1.5.2 猴耳环水在体外对流感病毒所致细胞病变的影响(CPE法)[5] 

  取已长成单层细胞的培养板,倒掉培养液,加入相应稀释度的药液,100μl/孔,每个稀释度平行做4个复孔。置37℃ 5% CO2培养箱中作用1h后倒掉药液,接种100倍TCID50(半数感染量)的病毒液,50μl/孔,置37℃ 5% CO2培养箱中吸附1h后倒掉病毒液,用细胞维持液冲洗细胞2次,再加入相应稀释度的药液,同时设病毒对照、病毒唑对照及正常细胞对照,置37℃ 5% CO2培养箱中培养,每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况。细胞病变程度(Cytopathic effect,CPE) 按以下6级标准判断:“-”为细胞生长正常,无病变出现;“±”为细胞病变占整个单层细胞的0~10%;“+”为细胞病变约占整个单层细胞的10%~25%;“++”为细胞病变约占整个单层细胞的25~50%;“+++”为细胞病变约占整个单层细胞的50%~75 %;“++++”为细胞病变约占整个单层细胞的75 %以上。当病毒对照组细胞病变为“++++”时记录实验结果,经秩和检验与病毒对照组比较P<0.05(CPE 为“++”以下) 判断为有效。并按Reed-Muench[6]计算半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)。TI= TC50/IC50。

  1.5.3 猴耳环水提取物体内对小鼠流感病毒性肺炎的影响[5]
 
  取昆明种小鼠60只,随机分成正常对照组、病毒感染对照组、病毒唑组、猴耳环水提取物低、中、高3个剂量组,共6组,每组10只。除正常对照组外,其余各组小鼠用乙醚轻度麻醉,选用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1的15个LD50病毒浓度,滴鼻感染小鼠,每只0.05ml。从感染前1d开始按0.1ml/10g的剂量灌胃给药,每天2次,连续5d,病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。第6d称取小鼠体重后解剖,肉眼观察肺部病变,记录肺部肝样实变的程度,摘取全肺称重,与体重计算肺指数值,并求出肺指数抑制率。计算公式如下:

    肺指数=[肺重(g)/体重(g)]×100%

    肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值)/病毒对照组肺指数均值×100%

  1.5.4  猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡的影响[5] 

  取昆明种小鼠90只,随机分成病毒感染对照组、病毒唑组、猴耳环水提取物低、中、高3个剂量组,共5组,每组18只。各组小鼠用乙醚轻度麻醉后,以2个LD50病毒浓度的流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1病毒液滴鼻感染,每只0.05ml。从感染前1d开始按0.1ml/10g的剂量灌胃给药,每天2次,连续5d,病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。观察并记录感染后小鼠的死亡数,计算死亡率、保护率、平均存活天数及生命延长率。计算公式如下:

    死亡保护率=(病毒感染对照组死亡率-试验组死亡率)/病毒感染对照组死亡率

    生命延长率=(试验组平均存活天数-病毒感染对照组平均存活天数/病毒感染对照组平均存活天数)×100%

  1.6  统计学方法 

  采用SPSS10.0 软件包进行统计分析,肺指数值、存活天数的比较采用组间t检验;保护率的比较用χ2检验。

  2 结果

  2.1 猴耳环水提取物体外抗流感病毒作用 

  实验结果表明,较大浓度的猴耳环水提取物对MDCK细胞具一定毒性,主要表现为细胞增殖缓慢、 颗粒增多、形态改变、折光性增强等,其TC50生药为24.91mg/ml;猴耳环水提取物在体外能抑制流感病毒所致的细胞病变,其IC50生药为3.33mg/ml。提示猴耳环水提取物在体外对流感病毒具有抑制作用,其TI为7.48。

  2.2 猴耳环水提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 
  由表1可见,猴耳环水提物低、中、高剂量组小鼠的肺指数值明显低于病毒感染对照组,与病毒感染对照组比较有显著性差异(P<0.01或0.05),提示猴耳环水提取物对流感病毒引起的小鼠肺部炎症有明显抑制作用。表1  猴耳环水提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响(略)注:与正常对照组比较,##P<0.01;与病毒感染对照组比较,P<0.05,P<0.01。

  2.3 猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用 

  由表2可见,在小鼠感染流感病毒后,病毒感染对照组94.4%动物出现死亡,平均存活8.1d。而低、中、高剂量猴耳环水提物能明显抑制流感病毒感染所致的小鼠死亡(猴耳环水提物低、中、高剂量组死亡率与病毒感染对照组比较,P<0.01或0.05),且能明显延长小鼠的平均存活天数(猴耳环水提物低、中、高剂量组存活天数与病毒组比较,P<0.01或0.05),提示中药猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡有明显保护作用。表2  猴耳环水提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用(略)注:与病毒感染对照组比较,P<0.05,P<0.01。

  3  讨论
   
  流行性感冒是由流行性感冒病毒(简称流感病毒)引起的急性上呼吸道传染病,具有传染性高、传播迅速、易发生流行等特点。根据病毒核蛋白基质蛋白抗原性的差异,流行性感冒病毒分为A型B型和C型,A型的病原性最强,为人与鸡、鸭、猪、马等动物共患[7];又根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性将其分成不同的亚型(HxNy)[8]。由于流感病毒的亚型变异速度很快,使得化学药物和流感病毒疫苗难以发挥其最佳治疗和预防效果。目前国内外用于抗流感病毒的药物有金刚烷胺与甲基金刚烷胺、病毒唑和干扰素等,由于其耐药性、毒性等问题而影响了其临床应用。而中药在防治流感方面具有一定的优势和广阔的发展前景,既有单味中药、也有经典复方,国内外在抗流感植物药的筛选研究方面已取得了可喜的进步[9]。
   
  以猴耳环嫩枝叶的水提浸膏为原料的猴耳环单方制剂—猴耳环消炎片,作为抗炎及呼吸道疾病治疗药物已得到广泛的应用,但目前尚未见有关猴耳环抗流感病毒作用的研究报道。本实验研究表明:猴耳环水提取物在体外对流感病毒引起的细胞病变有明显抑制作用,其IC50为3.33mg生药/ml,TI为7.48;在给药剂量为8~20g生药/kg时,对流感病毒致小鼠肺部炎症有明显抑制作用,并能显著降低流感病毒感染小鼠的死亡率和延长其存活时间,提示猴耳环水提取物在体内外均具有明显抗流感病毒的作用。以上实验结果为猴耳环及其相关制剂的临床应用提供了一定的实验依据。

【参考文献】
    [1]江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海:上海科学技术出版社,1999,1183.

  [2]中华人民共和国卫生部.药品标准.中药成方制剂(第6册)[M].1992,185~186.

  [3]Li Y, Ooi LS, Wang H, et al. Antiviral activities of medicinal herbs traditionally used in southern mainland China[J]. Phytother Res,2004,18(9):718~722.

  [4]李药兰,李克明,苏妙贤,等. 猴耳环抗病毒有效成分研究[J]. 中国中药杂志,2006,31(5):397~399.

  [5]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2003,1738~1740.

  [6]黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术[M].北京:科学出版社,1990,661~693.

  [7]温景芸,张扣兴,廖明,等.H5N1亚型禽流感病毒对小鼠致病性的研究[J].热带医学杂志,2006,6(1):5~7.

  [8]汪一帆,何卓晶,郭潮潭.抗流感病毒药物的研究概况及其进展[J].国际流行病学传染病学杂志,2007,34(1):37~40.

  [9]杨子峰,黄碧松,刘妮,等. 银翘散抗甲1 型流感病毒作用的实验研究[J].中国热带医学,2005,5(7):1423~1425.


作者单位:1.湖南省第二人民医院药剂科,湖南 长沙 410004; 1.湖南省第二人民医院药剂科,湖南 长沙 410004;

作者: 张中贤,黄剑臻,李沛波 2010-1-13
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