叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6增殖及TIMP-1mRNA表达的影响

【摘要】  　　目的 观察叶下珠复方Ⅱ号对肝星状细胞(HSC-T6)增殖及基质金属蛋白酶抑制因子mRNA（TIMP-1mRNA）表达的影响，探讨叶下珠复方Ⅱ号抗肝纤维化效果和作用机理。 方法 体外培养HSC-T6，随机分为对照组和叶下珠复方Ⅱ号5.00、2.50和1.25mg/ml组。加药后用MTT法检测各组HSC-T6增殖变化，且采用RT-PCR方法测定各组HSC-T6的TIMP-1mRNA表达。 结果 叶下珠复方Ⅱ号各剂量组药物对HSC-T6的增殖有明显的抑制作用，且TIMP-1mRNA表达都低于正常对照组。 结论 叶下珠复方Ⅱ号能抑制HSC-T6增殖和TIMP-1mRNA表达，从而减弱TIMP-1对基质金属蛋白酶的抑制作用，促进ECM的降解，这可能是叶下珠复方Ⅱ号抗肝纤维化的作用机制之一。

【关键词】  叶下珠复方Ⅱ号；肝星状细胞；基质金属蛋白酶抑制因子－1；细胞外基质；增殖

　　Impact of compound phyllanthus urinaria (CPUⅡ) on proliferation of HSC-T6 and expression of TIMP-1 mRNA.

　　SHENG Yang, LI Chang-qing, LIU Ni, et al.

　　(Institute of Tropical Medicine ,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine ,Guangzhou 510405, Guangdong, P. R. China)
   
　　Abstract：Objective  To observe the impact of compound phyllanthus urinaria (CPUII)  on the proliferation and expression of TIMP-1 mRNA of cultured hepatic stellate cells (HSC-T6), and explore the antifibrotic mechanisms of CPUⅡ  Methods  HSC-T6 were cultured in vitro and divided into 4 groups randomly, including control group,CPUⅡ5mg/ml group, CPUⅡ2.5mg/ml group, CPUⅡ1.25mg/ml group. After incubation with CPUⅡ, MTT colormetric assay was used to evaluate the inhibitive effect of CPUII on HSC-T6,and the expression of the TIMP-1 mRNA were determined  by using semi-quanititative RT-PCR method.  Results  The levels of proliferation of HSC-T6 and expression of TIMP-1 mRNA in every treatment groups were significantly lower than that of control group.  Conclusion  CPUII is capable of inhibiting HSC-T6 proliferation and down-regulating the expression of TIMP-1,thus the antifibrotic mechanism of CPUⅡ might be partly due to its downregulation of the expression of TIMP-1 mRNA and acceleration of  the degration of ECM in HSC-T6 cells.
   
　　Key words：Compound Phyllanthus UrinariaⅡ(CPUⅡ); HSC-T6; tissue inhibitor of metalloproteinase 1; ECM; Proliferation 

    肝纤维化是肝脏受到各种慢性损伤后发生的一种修复发应，其特征是以胶原为主的细胞外基质（ESC）在肝内过多沉积［1］。其中，肝星状细胞在肝纤维化发生发展中起着重要的作用［2］。被激活后的肝星状细胞能进一步转化为成纤维细胞，进而大量合成ESC。而在肝ESC形成过程中，主要受基质金属蛋白酶(MMP)及其抑制因子(TIMP)所调节［3,4］。本实验主要观察叶下珠复方Ⅱ号对肝星状细胞增殖及TIMP-1表达的影响，探讨其抗肝纤维化作用效果及作用机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料
 
　　HSC-T6细胞由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授惠赠;叶下珠复方Ⅱ号水提物，经加工制成含生药2g/ml的溶液。且在实验前对叶下珠复方Ⅱ号水提物进行低温间歇灭菌，-20℃保存备用。临时配成所需的药物溶度，且用5％血清的高糖DMEM培养液稀释;高糖DMEM培养液HEPEPS购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季清生物制品公司；L-谷氨酰胺、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和胰蛋白酶均购自sigma公司；EDTA购自上海生物工程公司Amresco进口分装；青霉素、链霉素购自华北制药有限公司；RT-PCR试剂盒（takara公司）;YJ-875型净化工作台，苏州净化设备公司；细胞培养瓶、细胞培养板、细胞计数板；微孔滤膜（0.45μm、0.2μm）,上海半岛实业有限公司；Leica荧光生物显微镜；倒置显微镜（Olympus BX600）；-86℃超低温冰箱（美国Revco）；美国SHELDON2300-2E型电热恒温CO2培养箱；美国宝特ELX800型全自动酶标仪；高速冷冻离心机；BIOMETRAPCR仪；EPS301电泳仪。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  细胞培养 

　　将冷冻保存于液氮中的HSC-T6细胞株复苏后接种于含10％胎牛血清、青霉素、链霉素各为100IU/ml、谷氨酰胺终浓度为0.03%、并用0.238％Hepes调PH值致6.8的高糖DMEM培养液中，37℃、5％CO2条件下培养。待细胞生长至铺满瓶底60％面积时，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA消化30s至1min后以1：2传代，24h换液，72h再次传代用于以下实验。

　　1.2.2  叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6细胞半数毒性浓度测定 

　　将传代的HSC-T6以2.0×105/ml的密度100μl接种于96孔板中，置于37℃，饱和湿度，5％ CO2培养箱内培养，24h将叶下珠复方Ⅱ号以50、25、12.5、6.25、3.125、1.56和0.78mg/ml药物浓度，按0.1ml/孔加入培养孔，各个浓度均设6个复孔。加药后的第4d，轻轻吸去上清，其后用MTT法，在酶标仪测定OD值（490nm）并取均数。

　　1.2.3  叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6细胞增殖的影响 
　　按以上方法，将传代的细胞以2.0×105/ml的密度100μl接种于96孔板中，置于37℃，饱和湿度，5％ CO2培养箱内培养，培养24h后，吸弃上清，而后分为4组：①对照组（正常组），加含5％的胎牛血清的DMEM培养液；②叶下珠复方Ⅱ号5mg/ml组，加含5mg/ml药物的5％胎牛血清的DMEM培养液；③叶下珠复方Ⅱ号2.5mg/ml组，加含2.5mg/ml药物的5％胎牛血清的DMEM培养液；④叶下珠复方Ⅱ号1.25mg/ml组，加含1.25mg/ml药物的5％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养。

　　1.2.3.1  MTT法检测HSC-T6细胞的增殖 

　　细胞接种于96孔板上，叶下珠复方Ⅱ号的各剂量组干预24、48、72和96h后，轻轻吸弃上清液，加入MTT，放入培育箱中，培育4h，再用DMSO将其溶解，其后用酶标仪测定OD值（490nm）并取其均数。

　　1.2.3.2  半定量RT-PCR检测TIMP-1mRNA表达 

　　①RNA抽提 用RNA抽提试剂盒按照厂家推荐的操作步骤抽提各瓶HSC-T6的总RNA，用分光光度计测定RNA的含量及纯度，A260～A280均在1.8～2.0之间。②cDNA的合成，采用20μl逆转录反应体系，内含代测RNA 2μg,  M-MuLV逆转录酶200U，RNA酶抑制剂20U，5×buffer 4μl,10Mm dNTP 2μl, 然后加DEPC处理的水至20μl。42℃反应60min， 停止反应继续加热至70℃ 10min。③引物：TIMP-1: antisense 5’CTGCGGTTCTGGGACTTG-3’,sense 5’-GCCTCTGGCATCCTCTTG-3’,扩增的片段长287bp。内参照GAPDH:  antisense 5’-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3’，sense 5’-CTACCCACGGCA AGTTCAAT-3’，扩增的片段长382bp。④共扩增PCR发应：发应体系为20μl,内含cDNA 4μl，10×buffer 2μl,dNTP(10mol/L) 0.4μl,上、下游引物各0.2μl, Taq酶0.5U,用水补至20μl。用BIOMETRA型PCR仪扩增。PCR发应的条件为：94℃ 5min，然后94℃ 45s,55℃ 30s,72℃ 1min,(35个循环)，72℃延伸5min。⑤半定量分析：PCR产物在3％琼脂糖凝胶上电泳后用凝胶成像系统。

　　1.3  统计学处理 

　　数据用均数±标准差表示，利用SPSS11.0软件进行统计分析。

　　2  结果

　　2.1  叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6生长的影响 

　　结果见表1。表1  叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6细胞半数毒性浓度测定药物浓度(mg/ml)ODIE(略)注：IE=1-ODi/ODO公式算出，IE表示药物对细胞增殖率的抑制率，ODi表示某药物溶度下的吸光度值，ODO表示对照组的吸光度值。然后根据TC50=Ln［(50-B)/(A-B)×C+LgC］,其中A：＞50％百分数；B:＜50%百分数；C＝Lg＞50％的溶度-Lg＜50%的溶度。算出此药物的TC50为6.61。

　　2.2  叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6细胞的增殖影响 

　　结果见表2。在药物作用的第3d，细胞开始出现凋亡现象，在镜下可见：细胞老化，轮廓不清，细胞内容物增多，形成空斑。从表2可以看出， 叶下珠复方Ⅱ号的5mg/ml组和2.5mg/ml组作用的效果明显，其中1.25mg/ml组也具有一定的作用效果。因此，说明了叶下珠复方Ⅱ号能够抑制HSC-T6增殖作用，且作用效果稳定。表2  叶下珠复方Ⅱ号对HSC-T6细胞的增殖影响（略）注：与空白对照组（0mg/ml）相比，P<0.05，P<0.01。

　　2.3  半定量RT-PCR检测TIMP-1mRNA表达 

　　正常对照组的TIMP-1mRNA/GAPDH（0.936±0.01）高于5mg/ml组（0.646±0.007,P＜0.01）、2.5mg/ml（0.765±0.02,P＜0.01）和1.25mg/ml（0.718±0.04,P＜0.01）组。提示叶下珠复方Ⅱ号可通过抑制TIMP-ImRNA的表达这一途径来发挥其抗肝纤维化作用,见图1。

　　3 讨论

    在临床上, 肝纤维化的发病机制多样且复杂, 其涉及病毒复制, 炎症介质的释放，免疫功能的紊乱和自由基损伤等多个环节。虽然导致肝纤维化的路径各不相同, 但目前认为肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化最终而共同的通路［5,6］。因为活化的肝星状细胞是合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原,层粘连蛋白等ESC的主要细胞来源，在肝纤维化的发生发展中起关键性作用［7］。本实验研究结果显示叶下珠复方Ⅱ号在5.0、2.5和1.25mg/ml无毒溶度下，对HSC-T6增殖有着明显的抑制作用。

　　TIMP1是抑制MMP活性的一组多功能因子家族的主要成员之一，能结合除MMP14、MMP19以外的所有MMP而使其活性减弱，阻碍了肝内多余胶原的降解，加速了肝纤维化进程［8～11］。TIMP1的主要细胞来源是激活的HSC，它虽不是肝纤维化的始发因素，但在肝纤维化的发展过程中起重要的促进作用［12］。其研究结果表明，叶下珠复方Ⅱ号5mg/ml组、2.5mg/ml组和1.25mg/ml组的TIMP-1mRNA表达明显低于正常对照组（P＜0.01），说明叶下珠复方Ⅱ号能直接抑制TIMP-1mRNA的表达起到抗肝纤维化作用。

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作者单位：广州中医药大学热带医学研究所,广东 广州 510405.