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首页医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2008年第8卷第2期

结核分枝杆菌ERIC-PCR分型技术的建立

来源:中国热带医学
摘要:【摘要】目的建立结核分枝杆菌ERIC-PCR分子生物学分型技术,并应用于临床分离菌株的流行病学调查。方法以肠杆菌科基因间重复序列(Enterbacterialrepetitiveintergenicconsensus,ERIC)为引物,对临床分离的结核分枝杆菌DNA进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到指纹图并进行分析。结论ERIC-PCR是结......

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【摘要】    目的 建立结核分枝杆菌ERIC-PCR分子生物学分型技术,并应用于临床分离菌株的流行病学调查。方法 以肠杆菌科基因间重复序列(Enterbacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)为引物,对临床分离的结核分枝杆菌DNA进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到指纹图并进行分析。结果 122株临床分离株产生42种不同的指纹图,密切接触者指纹图相同或相似,指纹图谱与患者年龄、菌株的耐药性及耐药种类有关。结论 ERIC-PCR是结核分枝杆菌分子流行病学调查的有效技术。

【关键词】  结核分枝杆菌; ERIC-PCR; 指纹图

  Development of DNA fingerprint of Mycobacterium Tubercul osis ERIC-PCR.

  PEI De-cui,WANG Xiang,WANG Jin-yong, et al.
  
  Department of  Microbiology, Yunyang Medical College(Shiyan 442000,China

    Abstract:Objective  To establish the ERIC-PCR DNA fingerprinting technique for typing Mycobacterium Tuberculosis and apply it in the epidemiological investigation.Methods  PCR was performed with the primers ERIC and DNA fingerprinting were analyzed by software.  Results  A total of 42 different fingerprints were detected.The characteristics of ERIC-PCR Fingerprint patterns were related to age, drug resistance and type of resistance. Conclusion  ERIC-PCR DNA fingerpriming technique developed in this study is effective way for molecular epidemiological investigation of Mycobacterium Tuberculosis.

    Key words:Tuberculosis Mycobacterium; ERIC-PCR; DNA fingerprint

    肠杆菌基因间重复序列为引物的聚合酶链反应(Enterbacterial repetitive intergenic consensus-PCR , ERIC-PCR) 分型技术是以肠杆菌科基因间重复序列中核心序列为引物进行PCR,扩增出多态性的DNA图谱。ERIC首先是Sharpies等[1]在分析大肠杆菌基因组中tls基因的3'端时发现的一种基因间重复序列(IRUs)。该序列长约124~127bp,并且在其中心存在高度保守长约40bp的核心序列。后来逐渐在其他一些革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌中也发现了该序列,1998年Sechi等[2]首次将该技术用于结核分枝杆菌的分型,并将其与IS6110及其他常见用于结核分枝杆菌分型的技术相比较,发现其具有更高的分辨率及快捷、方便的优点。
   
  结核病是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一。目前,用于结核病分子流行病学调查的方法主要是根据其插入序列或重复序列通过扩增或酶切杂交获得指纹图进行分析。国际上推荐的结核分枝杆菌复合群标准分型方法是IS6110-RFLP分型[3]。但该技术需要大量的DNA,操作复杂,对于含IS6110拷贝数少,甚至是零拷贝的菌株很难鉴别。因此逐渐建立了以PCR为基础的DNA指纹分型方法,以达到快速鉴定的目的。本研究,我们拟建立结核分枝杆菌ERIC-PCR分型技术,以期应用结核病流行病学调查。

  1  材料与方法

  1.1  菌株来源与鉴定 

  122株结核分枝杆菌来自十堰市疾病预防控制中心2003年9月~2006年3月门诊痰菌阳性患者。其中初治病人78例,复治病人44例。患者年龄17~80岁,平均37岁。所有菌株均按《结核病诊断细菌学检验规程》[4]进行鉴定并做药敏试验。

  1.2 DNA提取 

  痰菌阳性标本经碱处理,离心取沉淀接种于酸性改良罗氏培养基上培养3周,取一环细菌加100μl TE(10mmol/LTris-HC1 pH7.6,1mmol/LEDTA-Na2)混匀,100℃ 煮沸10min,12 000rmp离心12min,取上清做为PCR模板。

  1.3 PCR反应组成优化及重复性 

  为了实验的准确性和可重复性,分别从PCR反应的模板质量、Mg2+浓度、引物浓度、DNA聚合酶用量、dNTPs浓度几个方面逐一对PCR反应进行了优化组合,以选择最佳PCR组成,并对PCR条件进行了优化。取3株菌采用直接加热法和苯酚氯仿抽提两种方法提取模板[5], 同时采用3个不同时间段提取DNA,同一模板,同样反应体系及反应条件下重复三次PCR扩增。

  1.4 ERIC-PCR 

  所用引物序列为ERIC1:5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3'; ERIC2:5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3' (上海生工公司合成)。PCR扩增反应体系的组成为Taq DNA聚合酶(上海生工公司)2U,10×PCR buffer(100mmol/L Tris-HC1 pH8.3,50mmol/L KC1,0.1% BSA)2μl,Mg2+(25mmol/L)1.5μl,引物(20μmol/L)各0.2 μl,dNTPs(2mmol/L) 1.5μl,模板DNA (30ng/μl)2μl,加水补足反应体系至20μl。扩增在Biometra热循环仪上进行,热启动,PCR循环条件:97℃预变性10min,94℃变性1min,37℃退火2min,72℃延伸2min,共21个循环,随后94℃变性45s,58℃退火1min,72℃延伸2min,进行31个循环,72℃终延伸5min。取扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶(含0.5g/ml EB)中进行电泳(5V/cm)。

  1.5 DNA指纹图的计算机分析 

  电泳获得的指纹图条带有无采用“1”和“0”的方式记录在excel中,然后采用Freetree软件进行聚类分析,树状图由Unweighted pair group method with arithmetic averages分析产生,用Treeview软件观察结果。

  2 结果

  2.1 ERIC-PCR条件优化 

  通过对模板浓度、引物浓度、退火温度等影响ERIC-PCR 扩增的因素进行了探索和优化,最后确定了反应体系中引物为0.4μmol/L, Mg2+为1.8mmol/L,DNA模板量为60ng。PCR扩增采用热启动,引物二聚体形成显著减少。反应条件中退火温度采用37℃ 2min,共21个循环,紧接着再31个循环,其退火温度为58℃ 1min,扩增条带清晰稳定。

  2.2 ERIC-PCR的重复性 

  取3株菌按前述两种不同方法提取模板DNA进行扩增,以检验模板来源对扩增结果的影响。结果显示,这两种方法制备模板对PCR结果没有影响,但采用直接加热制备模板便宜、方便、快捷,故实验采用该法直接制备PCR模板。同时3株菌采用三个不同时间段提取DNA,做PCR及电泳,结果也一样,同一株菌不同时期PCR结果没有变化,说明ERIC-PCR重复性较好(图1)。

  2.3 ERIC-PCR指纹图 

  在上述试验条件下,对122株临床分离株进行扩增,均有扩增产物,122株产生42种不同的指纹图,产物大小约在120bp~2.3Kb之间,扩增条带数为5~11条,指纹图谱多态性较低,相同或高度相似的较多。A与B号为一对夫妻,其指纹图一样,D与E号是不同时间来自同一患者的痰液,指纹图也一样(图2)。

  2.4 ERIC-PCR指纹分型 

  人工计算扩增条带总数,根据Marker比较扩增带的大小,有某一条带的计为“1”,无此带的为“0”,然后用RAPD、PHYLIP、TreeView软件进行聚类分析,产生聚类图。122株菌中93株可以成簇,成簇率76.2%,分CⅠ、CⅡ、CⅢ 3簇,分别包括的菌株数为52、17、24株。另外有29株有独特指纹图,不能成簇。

  3 讨论

    ERIC-PCR原理类似于反向PCR,利用ERIC核心序列设计的反向引物可扩增出细菌基因组结构特征的条带。此外,由于ERIC序列为“重复性基因外回文”序列, 所以和其它基因分型方法不同, ERIC -PCR 理论上扩增出的是完整的基因片段,而不是酶切片段或随机片段。ERIC是主要存在于肠道细菌基因间的重复序列,它在基因组中较稳定,其分布和拷贝数具有种属特异性,因而可以用于对基因组进行分析研究。1991年Versalovic等[6]以ERIC的核心序列来设计引物( ERIC1 5'- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3', ERIC2 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')建立ERIC-PCR技术,并且在对革兰阴性菌的鉴定方面取得很好的效果。随后,该技术不断被应用到革兰阴性及阳性菌的鉴定、流行病学调查等方面的研究[7,8]。1998年Sechi等[2]将ERIC-PCR技术用于结核分枝杆菌指纹分析,发现ERIC-PCR用于结核分枝杆菌分析较PCR-GTG指纹图技术重复性好,与结核分枝杆菌标准分型方法IS6110-RFLP相比较分辨率更高,应用该技术他们将71株结核分枝杆菌分为59簇,研究表明ERIC-PCR技术可以用于该菌感染的流行病学研究。
  
  本实验,我们将ERIC-PCR技术用于临床分离结核分枝杆菌分析,采用热启动后,引物二聚体明显减少,并增加了反应的特异性,在PCR扩增中采用二种退火温度进行扩增,刚开始21个循环中采用37℃退火2min,使引物与ERIC序列更好的结合,提高敏感性,接着采用58℃退火1min,共31个循环,提高其特异性及产物量,与直接采用35个循环,退火温度52℃相比较,该方法PCR条带更清晰,能有效的扩增目的序列。实验表明ERIC-PCR对模板要求不是很高,采用直接加热法制备模板DNA和纯化DNA进行扩增结果相同,由于直接加热法更安全、简便、快捷,因此该技术较其他指纹技术用于结核分枝杆菌的研究更具有优势。
   
  本文结果表明,122株临床分离株产生42种不同的ERIC-PCR DNA指纹图,聚类分析结果显示成簇率为76.2%。根据成簇病例之间可以建立流行病学联系的假设[9],在本地,有高水平的结核传播。根据指纹图特征及流行病学资料表明,本地结核传播与患者年龄、接触程度、耐药性及耐药种类有关,而与性别无关。比较本实验电泳图谱上的扩增产物, 关系亲密者如夫妻或同一工作单位的患者痰结核分枝杆菌指纹图相同或相近,说明结核传播与接触程度有关;来源于不同地区、不同单位、工作生活上关系不大的患者痰结核分枝杆菌指纹图不同,表明此方法适用于DNA多态性的分析。由此可见, ERIC-PCR 作为一种简单、快速、有效的方法,对于探究结核病的感染源和传播途径等流行病学问题具有良好的应用前景。

【参考文献】
    [1]Sharpies GJ,Lloyd RG.A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes[J].Nucleic Acid Res, 1990, 18:6503~6508.

  [2]Sechi LA, Zanetti S, Dupre'I, et al. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequences as molecular targets for typing of Mycobacterium tuberculosis strains[J]. J Clin Micro,1998,36: 128~132.

  [3]Embden JDAV, Cave MD, Crawford JT, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology[J]. J Clin Micro,1993, 31:406~409.

  [4]中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志,1996,18:28~31.

  [5]肠杆菌基因间重复序列PCR指纹图谱技术分析结核分枝杆菌流行情况[J].中华检验医学杂志,2007,30:746~749.

  [6]Versalovic J,Koeuth T,Lupski JR.Distribution of repetitive DNA sequence in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J].Nucleic Acid Res,1991,19:6823~6831.

  [7]Matsumoto M, Suzuki Y, Miyazaki Y, et al. Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-based PCR (ERIC-PCR); its ability to differentiate Streptococcus pyogenes strains and applicability to the study of outbreaks of streptococcal infection[J]. Tohoku J Exp Med,2001,194:205~212.

  [8]Dalla-Costa LM, Irino K, Rodrigues J, et al . Characterisation of diarrhoeagenic Escherichia coli clones by ribotyping and ERIC-PCR[J]. J Med Microbiol,1998,7:227~234.

  [9]Godfrey-Fausser P.Interpretation of cluster studies of tuberculosis[J].lancet,1999, 353:427~428.


作者单位:郧阳医学院微生物教研室,湖北 十堰 442000; 2.十堰市疾病预防控制中心,湖北 十堰 442000.

作者: 裴德翠,王襄,王金勇,王娅,王淑兰 2010-1-13
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