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【摘要】 目的 探讨血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性和吸烟与缺血性脑卒中（IS）患病的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查454例IS患者(病例组)和334例非IS患者(对照组)的ACE基因的多态分布，采用非条件Logistic回归模型分析基因型、吸烟情况与缺血性脑卒中患病的关系。结果 携带有DD基因型和D等位基因的吸烟群体患缺血性脑卒中的相对危险度分别为1.992和1.679；而携带有II基因型的吸烟群体患缺血性脑卒中的相对危险度则为0.523。相反，非吸烟IS患者的ACE基因的各基因型和等位基因频率的分布与对照组相比，均无显著性差异（P>0.10）。结论 携带有D等位基因的吸烟群体容易患缺血性脑卒中，但携带有I等位基因的吸烟群体不容易患缺血性脑卒中，ACE基因与吸烟在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用。
【关键词】 脑卒中；缺血性；血管紧张素-1转换酶；基因；基因多态性；吸烟
Correlation of polymorphism of angiotensin converting enzyme gene and cigarette smoking with ischemic stroke.
LU Xi-lin, LI Cai-ming, WU Wan-ling, et al.
1.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong, P. R. China;
2. Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, 516001, Guagndong, P. R. China
Abstract：Objective To investigate the correlation of polymorphism of angiotensin converting enzyme(ACE) gene and cigarette smoking with ischemic stroke (IS). Methods Four hundred and fifty-four patients and 334 controls were recruited in this investigation, their ID polymorphisms of ACE gene were detected by polymerase chain reaction(PCR) and denaturing high performance liquid chromatogram(DHPLC). The correlation of genotypes and cigarette smoking and ischemic stroke risk were measured by odds ratios(ORs) and 95% confidence intervals (95%CIs). The ORs and 95% CIs were calculated by unconditional logistic regression. Results Compared to controls, OR of DD genotype and D allele in ischemic stroke patients of cigarette smoking was 1.992 and 1.679, respectively; but that the OR of II genotype in ischemic stroke patients of sigarette smoking was 0.523. On the other hand, the OR of all genotypes and alleles in ischemic stroke patients of non-cigarette smoking were not significantly different than those of the controls. Conclusion Cigarette smokers with D alleles are likely to suffer from ischemic stroke, but those cigarette smokers with I(II ?)alleles are not likely to suffer from ischemic stroke, and there is interactions between cigarette smoking and ACE gene in the pathogenesis of ischemic stroke.
Key words：Ischemic stroke; Angiotensin converting enzyme; Gene ; Genetic polymorphism; Cigarette smoking
缺血性脑卒中(Ischemic stroke, IS)是严重危害人类健康的疾病，其发病有众多而复杂的遗传和环境因素，基因变异是脑血管病的重要发病因素之一［1］。目前，血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)基因被普遍认为是研究各类心脑血管疾病转换遗传易感性的主要候选基因之一［2］。ACE基因多态性对缺血性脑卒中发病的影响也是近年来研究比较多的题目，但是将两者结合起来分析遗传和吸烟相互作用对缺血性脑卒中的发病影响情况报告还是鲜见，为此我们对血管紧张素转换酶基因多态性和吸烟与缺血性脑卒中患病的关系进行了研究。
1 资料与方法
1.1 研究对象
病例组为选择2000年9月～2005年3月在中山大学附属第一医院、惠州市中心人民医院及广东药学院第一附属医院神经科和急诊科住院的454例IS患者，其中男271例，女183例；年龄27～94岁，平均(65.20±12.75)岁，有吸烟史117例。所有患者均符合诊断要点［3］，并经临床、CT和(或)磁共振成像(MRI)扫描确诊；对照组为选择同期年龄、性别相匹配的其他科住院患者和健康体检者334例，其中男207例，女127例；年龄35～88岁，平均(59.57±16.73)岁，有吸烟史48例。均排除高血压病、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、癌症和肾功能衰竭等。按照统一标准［4～5］将缺血性脑卒中患者和正常对照组分为吸烟群体和非吸烟群体两部分。将每天至少吸1支烟，持续1年以上或戒烟时间少于半年为吸烟者。
1.2 方法
1.2.1 人血基因组DNA的提取
取外周静脉血5ml，用肝素抗凝，低渗法破红细胞，分离白细胞，经SDS和蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀提取基因组DNA。
1.2.2 ACE-1基因型检测
引物序列：P1：5'-CTGGAGACCACTCCCATCC TTTCT-3'； P2：5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'（上海生工），PCR反应体系为30μl，常规配制，94 ℃预变性5min后，按94 ℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，循环35周期，72℃延伸10min后终止扩增，用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳判断基因型。部分标本应用变性高效液相色谱“DNA Size”模式进行鉴定(柱温为50℃)。
1.3 统计学处理
采用SPSS11.0统计软件。基因型及等位基因相对风险率以比值比(OR)及95%可信区间(CI)表示，采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ACE-1基因多态类型（见图1～2）
PCR可扩增出两种DNA片段，一种是490bp长的DNA片段，称之为插入型(I型)；另一种是190 bp长的DNA片段，称之为缺失型(D型)。在群体中可有DD、ID及II 3种基因型，II为仅有490bp片段，为纯合插入型；DD型为仅有190bp片段，为纯合缺失型；ID型既有490bp片段，又有190bp片段，为杂合型。
2.2 ACE基因与吸烟在IS发病过程中的协同作用
（表1、2）携带有DD基因型和D等位基因的吸烟群体患缺血性脑卒中的相对危险度分别为1.992和1.679；而携带有II基因型的吸烟群体患缺血性脑卒中的相对危险度则为0.523。相反，非吸烟群体的ACE基因的各基因型和等位基因频率的分布与对照组相比，均无显著性差异，调整年龄、性别、血压、体重指数后，ACE基因多态性与吸烟对缺血性脑卒中发生交互作用有显著意义。表1 吸烟群体的ACE基因的各基因型分布特征组 （略）注：*与I等位基因相比。表2 非吸烟群体的ACE基因的各基因型分布特征组 别例数DDIDIID(略)注：*与I等位基因相比。
3 讨论
国内外学者对吸烟与缺血性脑卒中之间的关系进行了大量的研究，吸烟作为中青年脑梗死独化碳可引起机体一系列变化，导致血压增高、高密度脂蛋白降低和ApoB增高，高ApoB、低HDL能加速动脉粥样硬化的形成，故长期大量吸烟可使脑梗死的发病年龄提前，吸烟是缺血性脑卒中的直接危险因素；而Whisnant等认为：吸烟在致缺血性中风的危险因素随着年龄的增加而降低［7］,可见吸烟对青壮年危害性更大。吸烟可促使肾上腺分泌增加，从而促进血小板的聚集和动脉内皮细胞中的肌球蛋白异常收缩，使细胞间隙扩大，除乳糜微粒以外的其它脂蛋白通过细胞间隙进入内皮下层，并较长时间地停滞于内皮下层，形成动脉粥样硬化病灶。同时吸烟可提高红细胞压积，减少并干扰脑血流，促使血管闭塞；而且吸烟可增加血液粘滞性，对血液流变学有影响［8］；吸烟后，可使血栓素A2释放增多，脑血管收缩加强，脑血流减少，还可促进嗜铬细胞释放去甲肾上腺素，使血管收缩，血压增高，持续的高血压促进脑内小动脉壁玻璃样变性、粥样硬化，损害了维持脑血流稳定的动脉自动调节功能，导致动脉内皮损伤和血管狭窄，上述共同作用为栓子滞留和血栓形成具备条件，最终导致缺血性脑卒中［9］。可见，吸烟与缺血性脑卒中有明显的因果关系。亦有研究认为，吸烟是缺血性脑卒中复发的危险因素［10］。
目前关于基因与吸烟在缺血性脑卒中的发生发展过程中存在协同作用与否的研究不多。本研究结果表明，与对照组相比，携带有DD基因型和D等位基因的吸烟群体患缺血性脑卒中的相对危险度分别为1.992和1.679；而携带有II基因型的吸烟群体患缺血性脑卒中的相对危险度则分别为0.523。相反，非吸烟群体的ACE基因的各基因型和等位基因频率的分布与对照组相比，均无显著性差异，调整年龄、性别、血压、体重指数后，ACE基因多态性与吸烟对缺血性脑卒中发生交互作用有显著意义。提示携带有D等位基因的吸烟群体容易患缺血性脑卒中，但携带有I等位基因的吸烟群体不容易患缺血性脑卒中，ACE基因与吸烟在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用，这与既往的研究［4,11］结果是一致的。
ACE基因与吸烟在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用的机理尚不明。本研究的结果表明，ACE基因可能通过影响动脉粥样硬化从而引起缺血性脑卒中，而吸烟亦可以促使动脉粥样硬化，故它们可能在动脉粥样硬化这一环节上起协同作用。因此，通过戒烟，尤其是对于携带有危险基因型的群体（如DD基因型），也许可以降低缺血性脑卒中的发生、发展，甚至复发。
【参考文献】
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作者单位：1.中山大学附属第一医院神经科,广东 广州 5100802.惠州市中心人民医院,广东 惠州 516001； 3.海南省农垦总局医院,海南 海口 570311；4.广东药学院第一附属医院神经科,广东 广州 510080.