点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞的影响。方法 兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组，对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养，实验组则分别加入含不同浓度地塞米松磷酸钠的DMEM培养液，应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖情况及其合成Ⅱ型胶原能力，并应用透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。结果 实验各组软骨细胞进入S期、G2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0/G1期的细胞比率增加，免疫细胞化学阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性，电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。 结论 地塞米松磷酸钠可抑制软骨细胞的增殖，可能与抑制关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白合的合成能力有关。
【关键词】 软骨细胞；地塞米松；细胞培养
Effects of dexamethasone sodium phosphate on rabbit articular chondrocytes cultured in vitro.
TANG Chen-feng, LI Guo-xin, WEN Jian, et al.
(Shenzhen Hospital of Beijing University , Shenzhen 518036, Guangdong, P.R. China)
Abstract：Objective To investigate the effects of dexamethasone sodium phosphate on proliferation of rabbit articular chondrocytes cultured in vitro. Methods Rabbit articular chondrocytes cultured in vitro were divided randomly into four groups. Cells of the control group were cultured in DMEM media without dexamethasone sodium phosphate; cells of experimental groups were cultured in DMEM media with different concentration of dexamethasone sodium phosphate respectively. Flow cytometry and immunocytochemistry were used to observe the effect of dexamethasone sodium phosphate on proliferation of chondrocytes and synthesis of typeⅡcollagen . The changes of ultrastructure of cultured chondrocytes were observed under transmission electron microscope. Results The cellular proportions of S period and G2+M period of the experimental groups decreased and the cellular proportions of G0/G1 period increased. There were significant differences between the average gray scale values of the experimental groups and those of the control group. Under transmission electron microscope the amount of rough surfaced end oplasmic reticula and mitochondria of the experimental groups decreased. Conclusion Dexamethasone sodium phosphate can inhibit the prolifreation of articular chondrocyte. The enhanced proliferation of chondrocyte may be due to the decrease of cellular proportions of S period. Dexamethasone sodium phosphate can inhibit the synthesis of type Ⅱcollagen and protein of chondrocytes. The injection of dexamethasone sodium phosphate into articular cavity may result in impairemen of articular cartilage and may accelerate the retrogrde degeneration of articular cartilage.
Key words：Chondrocyte; Dexamethasone; Cell culture
关节内注射糖皮质激素在治疗骨性关节炎及类风湿关节炎的临床实践中应用较广，使用后能迅速缓解炎症减轻症状。但也有文献报道，关节腔内多次注射糖皮质激素可造成关节退行性改变［1,2］。目前，关节内注射糖皮质激素仍存争议，糖皮质激素对关节软骨的作用机制尚不十分清楚。本实验采用兔关节软骨细胞体外培养的方法，观察地塞米松磷酸钠对兔关节软骨细胞增殖及代谢的影响，探讨糖皮质激素对关节软骨作用的机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料
新西兰白兔，DMEM培养基、胰蛋白酶（GIBCO公司），Ⅱ型胶原酶、地塞米松磷酸钠（SIGMA公司），Ⅱ型胶原单抗（NEOMARKERS公司），SABC试剂盒（BOSTER公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 软骨细胞的分离与培养
取1月龄新西兰白兔处死后，切取关节软骨，D-Hanks缓冲液冲洗2次。把软骨切割成1mm3大小的碎块，加入浓度为0.25%的胰蛋白酶5ml，37℃恒温振荡箱中消化30min后，以DMEM培养液终止消化。再加入浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶5ml，不断剪切、搅拌。镜下观察大部分细胞游离时，加入DMEM培养液5ml离心，用DMEM培养液洗两遍。按每瓶约1×106个软骨细胞接种于25cm2塑料培养瓶中，于37℃、饱和湿度、5% CO2细胞孵箱内培养。每天以倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长状况，细胞长满后用0.25%胰蛋白酶传代。
1.2.2 免疫细胞化学检测软骨细胞Ⅱ型胶原合成能力
将传代后的软骨细胞分别加入地塞米松磷酸钠浓度为0、0.02、0.1和0.5mg/ml的DMEM培养液，继续培养72h后终止培养。按10μl/片将细胞悬液滴加至预先用Poly-L-Lysine处理好的载玻片上，将涂片晾干后用4%多聚甲醛固定，贮存于-20℃冰箱中以备免疫组化检测用。用PBS代替一抗作空白对照，结果阴性；以正常软骨细胞作为阳性对照，结果阳性。在油镜(10×100)下观察免疫细胞化学阳性信号在细胞中的定位，对信号强弱作初步观察。用计算机图象分析系统（MPIAS-500）对阳性细胞的平均灰度进行定量分析，用平均灰度值表示Ⅱ型胶原的表达量，实验资料用x±s表示。
1.2.3 流式细胞术检测软骨细胞增殖
原代细胞接种于25cm2塑料培养瓶中，镜下观察细胞贴壁后，随机分为对照组和实验组（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ），对照组换液后只加入DMEM培养液，实验组分别加入地塞米松磷酸钠浓度为0.02、0.1和0.5mg/ml/ml的DMEM培养液，每组8瓶，继续培养72h。用胰蛋白酶消化后收集细胞，离心10min（1 000rpm），弃去上清液。用4℃预冷的0.01mol/l PBS 液0.5ml制成单细胞悬液，再缓慢加入4℃预冷的无水乙醇1.5ml，静置30min（4℃），要求细胞浓度为106/ml。取细胞悬液与等体积的光辉霉素（MI）染液混合，室温染20min，即可上机检测。
1.2.4 透射电镜观察软骨细胞超微结构
传代后的软骨细胞在其指数增长期时分别加入地塞米松磷酸钠浓度为0、0.02、0.1和0.5mg/ml的DMEM培养液，继续培养72h后终止培养。将培养瓶内细胞用0.25%胰蛋白酶消化，加入0.01mol/l PBS，离心10min（2 500rpm），弃上清。缓慢加入４℃预冷的2.5%戊二醛４ml，固定30min（4℃），1%四氧化锇后固定25h（4℃），于饱和双氧醋酸铀过夜（4℃），梯度乙醇脱水后用环氧树脂浸透、包埋、聚合，常规制作超薄切片及染色后，在透射电子显微镜下进行观察。
1.3 统计学处理
免疫细胞化学检测资料行单因素方差分析（ANOVA），流式细胞术检测资料行χ2方检验。以α＝0.05为检验水准。
2 结果
2.1 原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察
接种软骨细胞最初为圆球状，呈悬浮状态，有折光性。接种24～48h，细胞开始贴壁，细胞形态转为透明圆盘状，大部分细胞贴壁后，形态由圆盘状逐渐向外伸出突起，转变成多角形，少数呈梭形。随细胞分裂增殖，细胞密度增加，细胞形态趋于一致，逐渐融合形成单层，呈“铺路石”样外观，细胞内出现大量分泌颗粒。由于先用胰蛋白酶消化30min，去除了软骨表面的滑膜等结构，可以避免成纤维细胞等细胞成分的污染，因而获得的软骨细胞纯度很高。传代后，关节软骨细胞24h内贴壁，形态与原代细胞相似，生长迅速，7～10d即可形成单层。处理组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢。
2.2 免疫细胞化学检测结果
免疫细胞化学阳性信号为棕褐色颗粒，Ⅱ型胶原阳性信号定位于细胞胞浆。其阳性信号的平均灰度值如表1所示，各实验组阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性（P<0.05）。
2.3 流式细胞术检测结果
经含地塞米松磷酸钠的培养液作用的软骨细胞，各期细胞比率如表2所示，进入S期、G2+M期的细胞比率均较对照组减少（P＜0.05），G0/G1期细胞比率增加（P＜0.05）。
2.4 透射电镜观察结果
透射电镜下见对照组软骨细胞细胞核清晰，胞浆丰富、核周围有大量的线粒体、粗面内质网及高尔基体发达。实验组软骨细胞较对照组胞浆粗面内质网减少、脱颗粒，胞浆中分泌泡数量减少，线粒体数量减少、排列紊乱、出现断裂，并出现少量溶酶体。表1 各组关节软骨细胞Ⅱ型胶原平均灰度值的比较（略）注:*与对照组比较,P＜0.05;△与实验组Ⅰ比较,P＜0.05;▲与实验组Ⅱ比较,P＜0.05。表2 各组关节软骨细胞增殖周期分析（略）注:*与对照组比较,P＜0.05;△与实验组Ⅰ比较,P＜0.05;▲与实验组Ⅱ比较,P＜0.05。
3 讨论
3.1 地塞米松磷酸钠与软骨细胞增殖的关系及其机制
流式细胞术是对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选的一门技术，细胞周期DNA分析是其基本分析内容之一，而实施的技术是通过测定细胞增殖周期各时相的DNA含量来达到的。细胞周期分为间期和分裂期两个阶段，在间期中，细胞又分为G1期（DNA合成前期）、S期(DNA合成期)和G2期（DNA合成后期），这一过程主要完成DNA的合成。细胞群中多数细胞处于间期，少数细胞处于分裂期。DNA的合成反映细胞在体外培养过程中的生长复制能力，DNA含量的减少反映了细胞分裂后数量的减少，因为对同一个体来说细胞染色体和DNA含量除在分裂前期外是恒定的。本实验运用流式细胞仪对关节软骨细胞进行细胞周期DNA分析，发现实验组的软骨细胞S期、G2期细胞比率减少，G1期细胞比率相应增加，提示实验组软骨细胞的增殖活动减少是由于S期细胞比率减少、DNA合成受到抑制所致。
3.2 地塞米松磷酸钠与软骨基质合成的关系
软骨基质是由软骨细胞分泌的，对软骨细胞具有保护作用，同时为其提供营养和底物,并能完成转导和传递信号。Ⅱ型胶原是软骨基质中抗张力的主要成分，正常软骨中张力强度主要取决于胶原纤维含量的多少和纤维排列的顺序。胶原还具有维持蛋白多糖含量的作用，胶原合成的增加有利于形成新的基质。在关节软骨缺损时，因自身免疫反应，关节软骨中的胶原纤维受到破坏。胶原结构的破坏使位于其间的蛋白多糖暴露，易于裂解并引起免疫反应。蛋白多糖的丢失又加速了胶原网的破坏，这样互为因果使基质的破坏向深层推进。Miyazaki Y等［3］通过体外细胞培养鼠关节软骨的方法，发现地塞米松抑制软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原的合成。Nakamura-M等［4］给鼠肌注地塞米松，发现在软骨表层细胞中，处理组的Ⅰ型胶原免疫印迹强度升高，而Ⅱ型胶原免疫印迹强度降低。说明地塞米松使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少，Ⅰ型胶原增多。提示胶原成分由Ⅱ型胶原占优势转变为Ⅰ型胶原占优势是糖皮质激素注射后关节软骨退变、破坏的原因之一。
本实验采用免疫细胞化学的方法检测软骨细胞经地塞米松磷酸钠作用后Ⅱ型胶原合成能力的变化，结果显示各实验组阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性，说明各实验组细胞Ⅱ型胶原的表达均比对照组弱，提示地塞米松磷酸钠抑制关节软骨细胞的胶原合成能力。透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构显示实验组软骨细胞较对照组软骨细胞胞浆粗面内质网数量减少、脱颗粒，线粒体数量减少、排列紊乱、出现断裂现象。线粒体是细胞合成能量的场所，粗面内质网是细胞合成蛋白质的场所，软骨细胞中的粗面内质网数量是软骨细胞蛋白（包括蛋白多糖和胶原）合成的指示剂。本实验结果提示糖皮质激素可引起关节软骨细胞的活性及蛋白合成能力的下降。
软骨细胞无特异性的标志物，Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测结合取材部位，可鉴定为软骨细胞。因除软骨细胞、视网膜神经细胞，其它组织无合成Ⅱ型胶原的能力［5］。
3.3 地塞米松磷酸钠的临床应用
糖皮质激素应用短期内可通过抑制免疫反应减轻临床症状，但长期来讲可改变软骨细胞的表型，抑制软骨细胞的增殖功能及胶原的合成能力，诱发或加重关节软骨的损害。在关节炎及关节损伤的情况下，软骨基质遭到破坏，此时需要软骨细胞大量增殖、合成更多的软骨基质来进行修复。若此时软骨细胞表型发生改变，细胞的增殖和基质合成能力遭到抑制，就无法满足修复的需要，关节软骨的损害就会进一步加重。临床上关节腔内注射地塞米松磷酸钠常用量虽在短期内可减轻临床症状，但长期应用会造成关节软骨的损害，加速关节软骨退行性改变。建议临床上尽量避免长期使用地塞米松磷酸钠行关节腔内注射。
【参考文献】
［1］Papacrhistou G, Anagnostou S, Katsorhis T. The effect of intraarticular hydrocortisone injection on the articular cartilage of rabbits［J］. Acta Orthop Scand Suppl, 1997, 275: 132～134.
［2］刘昆鹏, 陈百成. 节内注射糖皮质激素对关节软骨影响的实验研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2001,8(7):674～677.
［3］Miyazaki Y, Tsukazaki T, Hirota Y, et al. Dexamethasone inhibition of TGF beta-induced cell growth and type II collagen mRNA expression through ERK-integrated AP-1 activity in cultured rat articular chondrocytes［J］. Osteoarthritis Cartilage, 2000, 8(5):378～385.
［4］Nakamura-M, Watanabe-J, Ogawa-R, et al. Immunohistochemical localization of type II and type I collagens in articular cartilage of the femoral head of dexamethasone-treated rats［J］. Histochem-J, 1997, 29(9): 645～654.
［5］顾天爵. 生物化学［M］.第3版. 北京: 人民卫生出版社, 1989,20～23.
作者单位：北京大学深圳医院骨科,广东 深圳 518036.