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【摘要】 目的 建立阪崎肠杆菌的PCR检测方法。方法 用热裂解法和酚-氯仿法提取DNA。针对阪崎肠杆菌的ompA基因设计引物，优化PCR条件，验证其特异性和敏感性。 结果 优化后的条件选择为：Mg2+浓度2.0mmol/l，退火温度60℃；PCR扩增后，出现469bp的产物,具有良好特异性；采用酚-氯仿法时，其最小检出量103CFU/ml菌液,热裂解法，为105CFU/ml菌液。结论 优化的PCR检测阪崎肠杆菌条件，显示方法灵敏、特异快捷，可作为阪崎肠杆菌检测的新手段。
【关键词】 阪崎肠杆菌；快速检测；PCR
Establishment of a PCR method for detection of Enterobacter sakazakii.
ZHOU Ji-hai, HOU Dian-dong, HU Ying, et al.
1.Chinese Medical University，Shenyang 110001 Liaoning, P. R. China；
2.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110032, Liaoning, P.R. China
Abstract：Objective To establish a PCR method for detection of Enterobacter sakazakii. Methods DNA was extracted by thermal denaturalization method and phenol-chloroform method respectively. A pair of oligonucleotide primers were designed with ompA gene to detect Enterobacter sakazaki. In addition, PCR conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of PCR were determined. Results The optimized PCR condition were: the concentration of Mg2+ was 2.0mmol/l, the anealing temperature was 60℃. The predicted specific DNA amplcation bands of 469bp were obtained and the sensitivity of thermal denaturalization method and phenol-chloroform method revealed that as little as 105CFU/ml and 103CFU/ml of products could be detected, respcetively. Conclusion The method is specific, sensitive, and rapid. It is useful for the rapid detection of Enterobacter sakazakii.
Key words：Enterobacter sakazakii; Rapid detection; PCR
阪崎肠杆菌原先曾称阴沟肠杆菌，于20世纪80年代，以日本微生物学家阪崎利一的姓氏重新命名,实际上为肠杆菌科同名属中的一个种。由于能通过奶粉感染儿童，特别是引起新生儿严重的脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎，甚或遗留神经系统后遗症或导致死亡，近年来颇受重视［1～3］。对于阪崎肠杆菌，国内传统的检验方法步骤繁琐，检出时间可长达6～7d［4］，缺乏可操作性，不能满足现今细菌鉴定工作的需要。为此，我们尝试建立和优化PCR方法，使之实现快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验采用的菌株［阪崎肠杆菌（2株，其中一株为标准株，另一株为野生株）、大肠埃希菌（8株）、沙门菌（4株）］，均由辽宁省疾病预防控制中心提供;Taq DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、PCR分子量标记均购自宝生物工程(大连)有限公司。GeneFinder购自厦门百威信生物科技有限公司。MLST培养基、脑心浸液、营养肉汤（购自北京陆桥技术有限责任公司）。其它试剂均为分析纯;引物根据参考文献［2］合成,利用阪崎肠杆菌ompA基因设计引物ESSF和ESSR,委托宝生物工程(大连)有限公司合成,其序列如下。
ESSF 5'-GGATTTAACCGTGAACTTTTCC-3'
ESSR 5'-CGCCAGCGATGTTAGAAGA-3'
该引物产生469bp的扩增产物。
1.2 方法
1.2.1 菌种准备
将实验所用各菌株分别接种至营养肉汤中, 37℃过夜培养。
1.2.2 DNA模板的制备
取1.5ml过夜培养物加入Eppendorf 管,10 000r/min离心5min，弃上清液，加200μl蒸馏水，放入100℃煮沸10min，再以12 000r/min离心5min，取上清液为DNA模板，-20℃保存，备用。
1.2.3 酚-氯仿法DNA模板制备
取液体培养基1.5ml于1.5ml离心管中，离心30s，去上清液，加入567μl TE 缓冲液，充分混匀，加入30μl 10% SDS 和3μl 20mg/ml 蛋白酶K混匀，37℃水浴1h。加入100μl 5mol/L NaCl充分混匀，加入80μl CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃水浴10min；加入等体积的氯仿/ 异戊醇混匀，4℃离心5min，取上清液于另一1.5ml离心管中，加入等体积的酚/ 氯仿/ 异戊醇混匀，4℃离心5min，将上清液移入另一干净1.5ml离心管中；加入等体积的异丙醇，在室温下静置2min，4℃离心5min，弃上清液；加入1ml 70%冷乙醇，将沉淀悬浮洗涤30s，4℃离心5min，弃上清液；待沉淀完全干燥后，加入25μl灭菌蒸馏水溶解沉淀，4℃放置30min以上，使DNA充分溶解，-20℃保存，备用。
1.2.4 扩增体系和程序
反应体系(50μl) : 10×Ex Taq buffer(Mg2+ free)5μl, 正、反向引物各1μl(1μmol/L), dNTPs4μl（2.5mM each）, Taq酶0.25μl（5U/μl）,模板为3μl,mg2+(浓度通过条件优化选择)，加双蒸水补足50μl;扩增反应程序: 94℃预变性，3min；94℃变性，30s，退火（温度通过条件优化选择），45s，72℃延伸，45s，35个循环；72℃，5min。用1×TAE电泳缓冲液配制2%琼脂糖凝胶，上样量为5μl，电泳电压为100V，40min。用凝胶成像系统观察电泳结果并进行分析。
1.2.5 PCR反应条件的优化
PCR反应条件的优化主要通过选择最适Mg2+浓度以及最佳退火温度来实现。选择0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0mmol/l等8个MgCl2浓度，退火温度选择为50～60℃，进行棋盘滴定测试。
1.2.6 灵敏度测定
配制108CFU/ml浓度菌液，然后无菌操作按10倍递增稀释，使菌液浓度为107～100CFU/ml,并进行菌落计数,取各浓度菌液1ml分别用热裂解法和酚-氯仿法提取DNA ,进行PCR检测后,计算检出限。
1.2.7 特异性测定
对经验证（以传统的细菌培养法）的2株阪崎肠杆菌（其中一株为标准菌株，另一株为野株）进行PCR特异性检测。另外，利用经过鉴定的12株非阪崎肠杆菌株（大肠埃希菌、沙门菌）验证其特异性。
2 结果
2.1 PCR检测体系的优化
在Mg2+浓度为0.5～5.0mmol/l,退火温度为50～60℃条件下均可扩增出特异性条带。但Mg2+浓度在2.0mmol/l及以上时，条带比较清晰，而且适合于测试的各种退火温度。故优化后的条件选择为：Mg2+浓度2.0mmol/l，退火温度60℃。
2.2 方法的特异性
从图1可见，经传统方法鉴定的2株阪崎肠杆菌全部扩增出469bp的产物，而12株非阪崎肠杆菌均未扩增出此产物。
2.3 方法的灵敏度
以优化的PCR反应条件进行方法的敏感性分析酚-氯仿法最小检出量为103CFU/ml菌液，热裂解法最小检出量为105CFU/ml菌液，见图2。
3 讨论
近年注意到阪崎肠杆菌对于儿童健康构成威胁，其检测受到重视。与传统方法相比，PCR方法不仅操作简单，且灵敏度高，特异性好，可迅速报告结果，为许多相关部门所欢迎。
鉴于该菌的外膜蛋白A(OmPA)基因具有高度保守性，Nair［5］等通过鉴定和分子克隆OmPA基因，建立针对该基因的PCR检测法。在此基础上，我们优化了实验条件，确定了最佳Mg2+浓度以及退火温度。结果表明，利用针对OmPA基因设计的引物，经PCR扩增后，产物对阪崎肠杆菌具有较好的特异性。此外，本次实验对不同方法提取的模版测试其灵敏度，结果也很意义：用酚-氯仿法提取（抽提法），检测灵敏度达103CFU/ml增菌液；热裂解（裂解法）灵敏度为105CFU/ml。显示前者更加敏感。该法是提取DNA常规方法，可通过有机溶剂抽提去除样品中蛋白质，提高核酸纯度。虽如此，抽提法尚有其不足之处，比如操作较繁琐、耗时长及费用高等，故尚不可忽视裂解法，但须考虑到其可能遗留有蛋白质而影响检测结果。
总之，本实验将阪崎肠杆菌PCR检测方法的条件予以优化，能更好地应用其实施快速检测，故具有实际意义。
【参考文献】
［1］Block C, Peleg O, Minster N, et al. Cluster of neonatal infections in Jerusalem due to unusual biochemical variant of Enterobacter sakazakii［J］. Eur J Clin MicrobioI Infect Dis, 2002, 2l(8):613～616.
［2］Van Aker J, De Smet F, Muyldermans G, et al. Outbreak of necrotizing enterecolitis associaed with Enterobacter sakazakii in powdered milk［J］. J Clin Micrebiol, 2001, 39(1):293～297.
［3］刘秀梅, 裴晓燕, 郭云昌.中国安徽阜阳劣质婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的污染［J］.中国食品卫生杂志,2005,17(1):10～12.
［4］张爱霞,生庆海,张涛. 食品中阪崎肠杆菌分析及其检测［J］.中国乳品工业,2005,33(10):42～44.
［5］Manoj Kumar Mohan Nair, Kumar S. Venkitanarayanan. Cloning and Sequencing of the ompA Gene of Enterobacter sakazakii and Development of an ompA-Targeted PCR for Rapid Detectionof Enterobacter sakazakii in Infant Formula［J］. Applied and environmental microbiology,2006,72(4): 2539～2546.
作者单位：1. 中国医科大学公共卫生学院，辽宁 沈阳 110001； 2. 辽宁中医药大学基础医学院,辽宁 沈阳 110032；3. 辽宁省疾病预防控制中心,辽宁 沈阳 110005.