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【摘要】 目的 探讨甲羟孕酮（MPA）及米非司酮（RU486）对人卵巢癌耐药细胞系SKOV-3/DDP耐药性的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，比较不同浓度MPA、RU486、MPA +RU486对SKOV-3/DDP细胞生长及对DDP耐药性的影响。结果 一定剂量RU486或较大剂量MPA能够抑制SKOV-3/DDP增殖；较大剂量MPA或RU486能够增强该细胞系对DDP的敏感性。RU486浓度为40μg/ml时，MPA+RU486对SKOV-3/DDP细胞生长有抑制作用，可以逆转DDP引发的耐药。在同一MPA浓度下，随着DDP浓度的升高，抑制率逐渐升高。结论 较大剂量MPA或RU486可以逆转DDP引发的耐药,有望成为临床化疗时的辅助用药。
【关键词】 米非司酮; 甲羟孕酮; 卵巢癌; 耐药逆转
Effect of medroxyprogesterone and cisplatin- intensified mifepristone on drug-resistant ovary cells.
CHEN Jin, ZHANG Shu-rong, LIU Yu-xia, et al.
(Haikou Municipal People’s Hospital, Haikou 570208, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To discuss the impact of mfeprostone (MPA) and medroxyprogesterone (RU486) acetate on drug resistance of human ovary cancer drug-ressistant cell line SKOV-3/DDP. Methods Thiazolyl blue was used and the impact of concentrations of MPA、RU486、MPA +RU486 on the growth of SKOV-3/DDP cell and the resistance of SKOV-3/DDP to DDP was observed. Results RU486 of certain concentration or MPA at relatively high concentration could inhibit the growth of SKOV-3/DDP cells and revsere the resistance to DDP, The resistance rate would increase along with the increased concentration of MPA at the same concentration. Conclusion MPA and RU486 is capable of reversing the drug resistance arised due to DDP, while combined use of MPA an RU486 can enhance the activity of DDP. Therefore MPA and RU486 might be used as an adjuvant in chemotherapy.
Key words：Mifeprostone; Medroxyprogesterone Acetate; Ovary; Drug resistance
以顺铂为主的多种化疗药物联合化疗，在卵巢癌化疗中取得了较好效果，但也出现了对顺铂的耐药问题，使化疗减效和复发率升高。有研究发现，孕酮及米非司酮可逆转P-糖蛋白介导的耐药。本研究对甲羟孕酮及米非司酮体外增强顺铂对耐药人卵巢癌细胞作用进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 耐药细胞株
人卵巢浆液性囊腺癌细胞，1976年建株。吉林省肿瘤研究所诱导、传代培养。
1.2 试剂
DMEM培养液、四甲基偶氮唑蓝盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；顺铂（DDP）为江苏豪森药业股份有公司。
1.3 MTT法检测甲羟孕酮、米非司酮对SKOV-3/DDP细胞生长及耐药性情况
用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的SKOV-3/DDP细胞，调细胞浓度为5×104/ml，接种96孔板，每孔100μl，置于37℃、5% CO2条件下培养24h，待细胞贴壁后加入新鲜配制的不同浓度梯度药物，每组4复孔。实验分组：①米非司酮组：米非司酮浓度分别为5、10、20、40、80、160、320μg/ml；②米非司酮+顺铂组：米非司酮浓度同上。顺铂浓度分别1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/ml；③甲羟孕酮组：甲羟孕酮浓度分别4、8、16、32、64、128、256μg/ml；④甲羟孕酮+顺铂组:甲羟孕酮浓度、顺铂浓度同上；⑤米非司酮+甲羟孕酮组：米非司酮浓度为40μg/ml。甲羟孕酮浓度分别8、16、32、64、128μg/ml；⑥米非司酮+甲羟孕酮+顺铂组：米非司酮浓度、甲羟孕酮浓度同⑤。顺铂浓度同②。米非司酮、甲羟孕酮均用无水乙醇溶解。设相应的乙醇对照组，使乙醇终浓度与各加药组乙醇含量一致。继续培养48h，实验终止前4h每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h后弃去上清液，每孔加入150μl DMSO，充分震荡混匀，用酶标仪测定每孔492nm吸光度值，检测IC50值并计算抑制率。抑制率=1-（用药组OD值/无药对照组OD值）×100%。
1.4 统计学处理
资料输入计算机应用SPSS10.32统计软件，进行q检验。
2 结果
2.1 单纯米非司酮对SKOV-3/DDP细胞生长的影响
与无药对照组相比，各浓度的米非司酮对SKOV-3/DDP细胞均有不同程度的抑制作用，并呈浓度依赖性。米非司酮浓度5、10、20、40、80、160、320μg/ml对SKOV-3/DDP细胞增殖的抑制率分别为1.49、4.09、20.49、31.88、50.91、64.29和79.35%，各组间差别有统计学意义(P<0.05)。
2.2 米非司酮对SKOV-3/DDP细胞生长及耐药的影响
较大剂量米非司酮（≥20μg/ml）能够显著抑制SKOV-3/DDP增殖，并能增强该细胞系对顺铂的敏感性。在同一顺铂浓度下，两药合用时的生长抑制率，随米非司酮浓度（>20μg/ml）增加而增加，二者间有极显著性差别(P<0.01)。单纯顺铂IC50为9.9911μg/ml，顺铂+米非司酮（5、10、20、40、80、160、320ug/ml）的IC50分别为10.5551、10.6690、7.9404、2.1910、0.5290、0.4788、0.2354μg/ml,在米非司酮浓度>20μg/ml时IC50随米非司酮浓度增加而下降，各组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3 单纯甲羟孕酮对SKOV-3/DDP细胞生长的影响
与无药对照组相比，MPA浓度≤16μg/ml时，不能有效地抑制SKOV-3/DDP增殖，浓度达到32μg/ml时，MPA对SKOV3/DDP细胞均有不同程度的抑制作用，并呈浓度依赖性。MPA浓度32、64、128、256μg/ml时对SKOV-3/DDP细胞增殖的抑制率，分别为0.24%、3.89%、21.40%、38.88% 。在MPA浓度>32μg/ml时抑制率随MPA浓度增加而增加，各组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
2.4 甲羟孕酮对SKOV-3/DDP细胞生长及耐药的影响
MPA浓度≤16μg/ml时不能有效地抑制SKOV-3/DDP增殖，浓度达到32μg/ml时能显著抑制SKOV-3/DDP增殖，逆转该细胞系对顺铂的耐药。单纯顺铂IC50为5.2129μg/ml，顺铂+MPA（32.00、64.00、128.00、256.00μg/ml）的IC50分别为3.2098、2.5064、1.8322、1.0127μg/ml，各组与对照组相比有统计学意义（P＜0.05），各组间无统计学意义(P＞0.05）。
2.5 甲羟孕酮、米非司酮对SKOV-3/DDP细胞生长及耐药的影响
由表1可以看出，米非司酮浓度为40μg/ml时，甲羟孕酮、米非司酮与顺铂三药合用对SKOV-3/DDP细胞生长，有不同程度的抑制作用，可以逆转顺铂引发的耐药，顺铂浓度在1.25、2.50、5.00μg/ml时，三药合用时的生长抑制率随甲羟孕酮浓度增加而增加。顺铂浓度在2.50、5.00μg/ml时逆转效率最好；但随顺铂浓度的升高，这种逆转作用反而有下降趋势，在同一MPA浓度下，随着DDP浓度的升高，抑制率逐渐升高。表1 甲羟孕酮、米非司酮对SKOV-3/DDP细胞生长及耐药的影响（略）
3 讨论
肿瘤细胞减灭术及术后化学治疗（化疗），是目前治疗卵巢癌的主要手段，但化疗的耐药问题严重影响化疗的效果。本研究应用MTT法，发现各浓度米非司酮对SKOV-3/DDP细胞均有不同程度的抑制作用，并呈浓度依赖性。在米非司酮浓度>20μg/ml时，不但能够显著抑制SKOV-3/DDP增殖，并能增强该细胞系对顺铂的敏感性。在同一顺铂浓度下，两药合用时的生长抑制率，随米非司酮浓度增加而增加。米非司酮浓度为40μg/ml时，甲羟孕酮、米非司酮与顺铂三药合用对SKOV-3/DDP细胞生长，有不同程度的抑制作用，可以逆转顺铂引发的耐药，但随顺铂浓度的升高，这种逆转作用反而有下降趋势，顺铂浓度在1.25、2.50、5.00μg/ml时，三药合用时的生长抑制率随甲羟孕酮浓度增加而增加。顺铂浓度在2.50、5.00uμg/ml时效率最好。而在同一MPA浓度下，随着DDP浓度的升高，抑制率逐渐升高。这表明米非司酮除其本身的抗肿瘤活性外，尚可在一定程度上逆转肿瘤细胞的多药耐药性，起到化疗增敏作用，该作用主要与其降低P-糖蛋白［1］和MRP介导的细胞内药物外排作用，增加细胞。王刚等［3］研究发现对于耐受浓度的顺铂加用米非司酮，能够发挥二者的协同效应，起到类似化疗增敏的作用，但对于尚能有效杀伤肿瘤细胞的顺铂浓度，二者并不能发挥明显的协同作用，因而临床上应用米非司酮作为肿瘤辅助治疗时，对于顺铂敏感和接受大剂量化疗的患者并无多大价值，而主要适用于对顺铂等化疗药物耐药的病例，且应在机体耐受的剂量范围内，尽可能提高顺铂和米非司酮的剂量，以充分发挥米非司酮和顺铂自身的抗肿瘤效应，并利用二者的协同效应以提高抗肿瘤效果。
本研究表明，甲羟孕酮浓度达到32μg/ml时能抑制SKOV-3/DDP增殖，并能增强该细胞系对顺铂的敏感性。甲羟孕酮浓度为1～16μg/ml时，对SKOV-3/DDP细胞生长无显著影响，这可能与SKOV-3/DDP细胞缺乏孕激素受体有关。而高浓度甲羟孕酮表现的抑制作用，也可能是通过某种受体外机制起作用。研究表明，孕激素是一种有效的MDR逆转剂［4］。其机制为：①对MDR基因的调节：孕激素对MDR基因的调节是基因和受体特异性的，孕激素只特异性地通过孕激素A受体激活MDR1b基因的增强子序列，诱导MDR1b的表达，而对孕激素B受体和MDR1a均无作用［5］。②孕激素对胆固醇合成及酯化的影响：孕激素可以通过抑制P-gp对胆固醇及其前体的细胞内转运，抑制胆固醇的合成及酯化，造成细胞胆固醇营养缺乏以至死亡。另有学者认为，其逆转MDR1的作用并非通过孕激素受体的介导，而是通过孕激素特异性地与P-gp分子上的某一疏水区结合，从而抑制P-gp对药物的转运；孕激素的疏水性结构与其逆转MDR1的作用明显相关。
孕激素及米非司酮在逆转MDR的有效浓度，对机体无严重的不可逆的毒副作用，这为临床治疗MDR肿瘤提供了一条可行的途径。然而低浓度孕激素，可以通过孕激素受体诱导MDR1b的表达，这可能在一定程度上影响孕激素的逆转作用。作为孕激素受体拮抗剂，米非司酮既可通过抑制P-gp逆转MDR，又可通过阻断孕激素受体拮抗孕激素对MDR基因的诱导作用。由于米非司酮口服方便，血药浓度高，半衰期长，对正常细胞毒性低，且同时兼有抗肿瘤活性和类似于化疗增敏的作用，因而可以作为临床治疗耐药和难治性卵巢癌的辅助药物，这为治疗MDR肿瘤提供更广阔的前景。
【参考文献】
［1］刘颖 ,王丽莉 ,邓 燕.米非司酮体内增强顺铂对人卵巢癌细胞的抗癌作用［J］. 第一军医大学学报, 2003,23(3):242～244.
［2］Liu YY，Han TY，Giuliano AE，et al. Ceramide glycosylation potentiates cellular multidrug resistance［J］.FASEB J，2001，15（3）：719～730.
［3］王刚，郑闻亭，肖平，等. 米非司酮对耐药卵巢癌细胞增殖、凋亡及其对顺铂敏感性的影响［J］.癌症，2004，23（4）：406～411.
［4］Lewin J,Cooper A,Birch B.Progesterone: a novel adjunct to intravesical chemotherapy［J］.BJU Int, 2002, 90(7):736～741.
［5］Kou MT, Julian J, Husian F, et al. Regulation of multidrug resistance gene mdr1b/mdr1 expression in isolated mouse uterine epithelial cells［J］. J Cell Physiol, 1995, 164(1):132～141.
作者单位：1.海口市人民医院妇产科，海南 海口 570208； 2.广东省深圳市南山区妇幼保健院，广东 深圳 518052；3吉林省肿瘤研究所,辽宁 长春１３００１２.