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【摘要】 目的 探讨一个表皮松解性角化过度鱼鳞病家系基因的突变。方法 提取表皮松解性角化过度鱼鳞病患者及家族成员的基因组DNA，采用PCR扩增COL7A1基因所有的外显子及其邻近的剪切点并进行双向直接测序，用PCR检测突变位点从而进一步确定家系的致病原因。结果 发现患者COL7A1基因的一条等位基因第2号外显子上存在S48P的错义突变，而另一条等位基因第27号外显子上存在3625del 11缺失突变，造成编码区阅读框架的移位，最终导致蛋白终止密码（PTC）的生产。结论 COL7A1基因的缺失突变和错义突变引起该患者临床症状的特异突变。
【关键词】 鳞癣；表皮松解；突变；编码Ⅶ型胶原的COL7A1基因
COL7A1 gene mutations in family with epidermolysis bullosa ichthyosis.
WANG Zhong, LIU Lian-qing, LING Hong-zhong, et al.
Meizhou institute of Chronic disease, Meizhou 514021,P. R. China
Abstract：Objective To investigate the mutations of the fish gene of epidermolysis bullosa hyperkeratosis pedigree. Methods The genomic DNA, COL7A1 gene of hyperkeratosis epidermolysis bullosa ichthyosis patients and family members was extracted by PCR amplification of all exons and in the vicinity shear sites and two-way direct sequencing. The mutation sites were detected by using PCR for further identification of the pathogenicity of epidermolysis bullosa hyperkeratosis ichthyosis. Results There S48P the missense mutation on allele gene No. 2 exons of COL7A1 and another one deletion mutation on allele No. 27 of the existence of exon 11 mutant del 3625 were observed, that resulted in the shifting of coding region of the open reading frame and eventually leading to the termination of production of code. Conclusion The deletion mutation and missense mutation of COL7A1 gene result in the specific mutation in patients with clinical symptoms.
Key words：Ichmellar；Epidermolysis bullosa；Mutation; COL7A1 gene
表皮松解性角化过度鱼鳞病（Epidermolysis bullosa hyperkeratosis ichthyosis）是一种罕见的常染色体隐性遗传性皮肤病,临床表现较为严重。编码Ⅶ型胶原的COL7A1基因突变可导致表皮松解性角化过度鱼鳞病的发生［1］。我们近期发现1例表皮松解性角化过度鱼鳞病患者，针对COL7A1基因进行基因突变研究，对其发病的分子基础与临床表型之间的关系进行了探讨。
1 病例与方法
1.1 临床资料
先证者男，30岁，生后全身皮肤潮红，覆盖有鱼鳞状皮屑，时有松弛性水疱。出生1个月后全身皮肤开始脱屑，鳞屑逐渐加重增厚，色深，肢体屈侧出现干裂、糜烂、渗出。至5岁时，皮损达到高峰，全身有大片褐色鳞屑，口唇及鼻黏膜也受影响。曾经进行过治疗，病情有所改善。患者父母否认近亲结婚，调查家系其他成员均无类似表现。体检：患者一般情况正常，智力正常，心、肺、腹无异常。皮肤科情况：全身被覆盖鱼鳞状、灰褐色鳞屑，以躯干为严重。组织病理学示表皮明显角化过度，棘层稍肥厚，棘层上部和粒层细胞内水疱，真皮浅层少量淋巴细胞浸润。本研究经该家系知情同意后，采集了患者及父母的血样和患者皮肤标本。
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA提取
采集表皮松解性角化过度鱼磷病患者、家系成员和50例健康人的静脉血5ml，2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，然后用酚-氯仿法提取基因组DNA，按照操作规程进行。
1.2.2 COL7A1的基因序列
从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上获得。用Primer5.0软件自行设计能够扩增COL7A1基因的15个外显子和邻近的剪切位点引物。其中为扩增2号外显子合成的引物：上游5＇-ACCATCCCAAGTCCCAGTGA-3＇。下游5＇-TGTTTCTGCAAAGACCTGGC-3＇。扩增27号外显子合成的引物:上游5＇-GTAAGGAGTAGGCTGATGGG-3＇，下游5＇-AGGGTCTCTTTGAGGTTGAA-3＇。
1.2.3 PCR反应体系和扩增条件
PCR反应体系为25μl，上、下游引物各10pmol/L,dNTP 10mmol/L，MgCl2 15mmol/L，Taq酶2.5u。反应条件：94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，共33个循环。
1.2.4 突变分析
取2μl PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析（溴化乙啶染色），用UNIQ-10柱式PCR产物纯化度试剂盒（Sangon）纯化PCR产物，纯化PCR产物后用ABI377型测序仪进行测序。
2 结果
2.1 PCR扩增
对PCR产物全部测序，结果与基因库（L23982）中正常序列相比较。
2.2 PCR产物测序分析
在PCR产物测序结果中发现患者第2号外显子上143C→T，导致丝氨酸被脯氨酸所替代（S48P），对其父母的第2号外显子进行扩增并直接测序，发现该患者的父亲存在此种错义突变，可以证实患者第2号外显子上发生143C→T的错义突变来自父方（图1）。另外，在患者的第27号外显子上发生了缺失突变，即在3625位发生11个碱基的缺失(3625del 11)，造成编码区阅读框架移位，产生提前终止密码（PTC），导致肽链合成提前终止。对其父母的第27号外显子进行扩增并直接测序，发现该患者的母亲存在此种缺失突变，可以证实患者第27号外显子上发生的移码突变3625del 11来自母方（图2）。
3 讨论
许多的研究表明表皮松解性角化过度鱼鳞病是一种遗传异质非常强的疾病。随着研究不断深入，有一部分的表皮松解性角化过度鱼鳞病患者是由于COL7A1基因突变导致。通过全基因组织扫描发现表明表皮松解性角化过度鱼鳞病新的致病基因位点分别是2q33-35、3p21、19p12-q12、19p13.1-p13.2、17p13和5q33等［2］。
COL7A1基因编码与膜相连的钙依赖性硫醇酶具有转移氨基酸到蛋白质的谷氨酸残基上形成异肽键的能力，参与角质包膜形成过程中ε-（γ谷氨酰）赖氨酸交联的形成［3］。这种交叉连接十分稳定，可以抵抗蛋白酶的水解作用，是角质形成细胞终末分化组成角质包膜的关键步骤，是皮肤屏障功能的物质基础。表皮松解性角化过度鱼鳞病患者中此的功能缺陷会显著影响正常角质包膜的形成，使皮肤的屏障功能受损，出现代偿性角化过度，引起患者的临床症状。
在人类常染色体隐性遗传性疾病中，只有某一致病基因的等位基因中的两个均发生突变时，疾病才能发生。对该家系的基因突变研究证实，该患者携带两个新的异源性突变：S48P的错义突变和3625del 11的缺失突变，其中前者来自父方，后者来自母方，虽然该患者的父母分别携带错义突变和缺失突变，但其父母临床表型正常，显然该家系为常染色体隐性遗传，而非该患者的“de-novo”突变。经50例健康对照的特异性引物PCR检测可以证实此碱基置换是导致该家系的特异性突变，其中父亲来源的错义突变即143C→T，而母亲来源的缺失突变3625del 11，即在第27号显子上发生11个碱基的缺失，导致第27号外显子发生移码突变。我们研究发现此突变造成编码区阅读框架的移位，产生提前终止密码，导致肽链合成提前终止，最终产生无意义的蛋白质。显然此突变是导致该患者致病的主要原因之一。
患者的父母虽然携带此缺失突变，但并未表现出临床症状，以往的研究证实患者父母的另一条正常的等位基因足以合成充分的mRNA来满足锚丝纤维的数量和质量［4］。
本研究发现的患者存在COL7A1基因突变，这对阐明角质包膜形成中相关酶的关键作用和表皮松解性角化过度鱼鳞病的发病机制具有重要意义。
【参考文献】
［1］蔡艳霞，李常兴，罗权，等.鱼鳞病综合征的遗传学进展［J］.国际皮肤性病学杂志，2006，32：315～317.
［2］Lefevre C,Bouadjar B,Karaduman A,et al.Mutations in ichthyin a new gene on chromosome 5q33in a new form of autosomal re-cessive congenital ichthyosis［J］. Hhm Mol Genet,2004,13:2473～2482.
［3］Nemes Z,Marekov LN,Fesus L,et al.A novel runction for transg-lutaminase l: atachment of long-chain omega-hydrosyceramides to involucrin by ester bond formation［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:8402～8407.
［4］Cserhalmi-Friedman PB,McGrath JA,Mellerio JE,et al.Restoration of open reading resulting from skipping of an eson with an in-ternal deletion in the COL7A1 gene［J］.Lab Invest,1998,78:1483～1492.