刚地弓形虫分子疫苗研究新进展

【关键词】  刚地；弓形虫；分子疫苗

　　刚地弓形虫(Toxoplasma gondii) 是一种专性细胞内寄生的重要机会致病性原虫（Opportunistic protozoan），因其生活史和致病机理复杂，直至目前尚未找到理想的治疗药物［1］。近年来，弓形虫疫苗和免疫保护性研究已逐渐引起了重视，并认为疫苗接种可能是预防弓形虫病的最佳策略［2］。随着生命科学高新技术的应用和发展，人们从分子水平上对这种专性细胞内寄生的原虫有了越来越深入的认识，对弓形虫抗原分析、疫苗研制及抗弓形虫免疫应答机制不断取得进展，现综述如下。

　　1  弓形虫候选分子疫苗抗原

    候选蛋白抗原包括细胞膜、细胞质和代谢抗原，与弓形虫的侵袭性和诱导宿主产生免疫反应有关，主要有表面抗原(Surface antigen，SAG)、致密颗粒蛋白(Dense granules protein，GRA)、棒状体蛋白(Rhoptry protein，ROP)和微线体蛋白(Microneme protein，MIC)等。

　　1.1  P30、P22、P18和P35表面抗原（SAG)  

　　P30蛋白又称表面抗原1(SAG1)，为速殖子期特异性蛋白，能够刺激机体产生IgG、IgM及多种细胞因子［3］，是研制弓形虫疫苗的重要候选抗原分子之一。P30基因全长序列1634bp，单拷贝，不含内含子，有一个单一开放阅读框(ORF)，编码336个氨基酸序列，分子量为30kD。Dzierszinski等［4］根据基因敲除实验认为P30可能是决定虫株毒力的重要因素之一。P22蛋白(SAG2)结构上与SAG1有很多相似之处，可使弓形虫附着于有核细胞表面，介导速殖子入侵，抗P22蛋白抗体则能阻断弓形虫的再定位。P22基因全序列1404bp，单拷贝，无内含子，含有一个561bp的ORF，编码蛋白分子量为22kD。Lekutis等［5］发现SAG2家族包含SAG2B、SAG2C和SAG2D，均有很高的同源性。P18又称表面抗原4(SAG4)，是一种缓殖子表面膜蛋白，普遍存在于急慢性弓形虫感染血清中，可引起机体早期细胞及体液免疫应答，抗原性很强［6］。P18基因全长2012bp，单拷贝，无内含子，其第700～1 218bp之间的519bp具有完整的ORF，能编码172个氨基酸，分子量为18ku。田春林等［7］采用PCR体外扩增方法成功获得SAG4基因575bp片断，经生物信息学分析，预测其编码的氨基酸可能具有一定的生物学活性。P35蛋白具有弓形虫速殖子阶段性特征，C端区有高亲水性，含多个T、B细胞表位，具有免疫诊断和疫苗开发的价值。P35基因含1537bp，编码378个氨基酸［8］。Aubert等［9］用直接ELISA包被P35用于急性和慢性弓形虫病鉴别诊断，可明显提高阳性检测率。

　　1.2  致密颗粒蛋白(GRA)GRA1和GRA7 

　　致密颗粒蛋白属分泌代谢抗原，主要包括GRA1- GRA9等9种分子，其中对GRA1和GRA7的研究较多。GRA1又称P24，为弓形虫分泌排泄抗原（ESAs）的重要成分之一，在修饰调理纳虫泡的结构中起重要作用。GRA1基因全序列1690bp，无内含子，含有573bp的ORF，编码蛋白分子量为24kD，可作为急慢性感染的诊断抗原及可能的侯选分子疫苗之一。GRA7在弓形虫速殖子、包囊及肠内期虫体均有分布，主要位于速殖子侵入后形成的纳虫泡和纳虫泡膜上，缓殖子的GRA7主要定位于宿主细胞的胞浆内。GRA7基因完整序列为792bp，单拷贝，含一个长597bp的ORF，编码分子量为29kD［10］。Vercammen等［11］用GRA1、GRA7和ROP2基因构建的DNA疫苗证实对免疫动物具有部分保护性，抗原性强于传统的强抗原rSAG1。

　　1.3  细胞穿透因子(PEF)ROP1和ROP2 

　　由弓形虫棒状体（Rhoptry）分泌，主要包括ROP1～ROP9等9种分子，目前对ROP1和ROP2的研究较多。ROP1蛋白分子量60kD，至少包括2个功能信号肽［12］，在虫体侵入宿主细胞时从棒状体释出，有增强弓形虫入侵宿主细胞的作用。ROP1为单拷贝基因，其mRNA大约为2.1kb，从第143个核苷酸到加“A”部位之间区域不含内含子。GuoH等［13］研究表明，重组质粒pcDNA3-ROP1能够诱导小鼠的细胞和体液免疫，增加T淋巴细胞和NK细胞数量。ROP2蛋白定位于纳虫泡表面，介导纳虫泡与宿主细胞线粒体和内质网接触，在弓形虫生活史各个阶段均可表达，具较强的免疫保护性。ROP2基因序列为1 683bp，单拷贝，无内含子，编码561个氨基酸。Roque-Resendiz等［14］用痘病毒（MAV）载体构建的MVA-ROP2重组体接种小鼠，然后用RH株弓形虫攻击，结果显示小鼠寿命明显延长，能够用于抗弓形虫保护性免疫。

　　1.4  微线体蛋白（MIC）MIC1、MIC2和MIC3 

　　微线体(Microneme)是顶复门(Phylum ApIcomplexa)原虫的一种细胞器，可经类锥体向外排放大量MIC，与宿主细胞膜上的相应受体结合成复合体(Tg-MIC1／MICA／MIC6、TgMIC3／MIC8、T gMIC2／M2AP)存在。Cerede等［15］在弓形虫入侵和毒力研究中，指出MIC蛋白(MICs)包括跨膜蛋白（TRAP）和可溶蛋白，表达不同的粘性区域，MIC1和MIC3是两种可溶性细胞表面配基，揭示了MICs在毒力和致病性中的协同作用。MIC2属于TRAP家族，是相对分子量(Mr)为95 000～100 000的可溶性蛋白。余南等［16］克隆并融合表达了刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽，为进一步深入研究其在弓形虫粘附和入侵中的作用奠定了基础；江涛等［17］应用生物信息学技术，对弓形虫MIC3的二级结构及其潜在的B细胞抗原表位进行了预测和分析，为弓形虫的新型疫苗研究提供了理论依据。

　　1.5  WX2、WX基因、组织蛋白酶 

　　吴翔等［18］用自制的抗弓形虫速殖子McAb免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库，对7C3-C3，2B9-G1筛选的阳性克隆进行测序，经Blast分析后得到两个新的基因，分别命名为WX2和WX，WX2长1515bp，含有2个完整的ORF，WX长984bp，含有1个完整的ORF，2种新基因编码抗原的单克隆抗体对弓形虫感染都具有一定保护性，有可能是较好的疫苗候选分子。编码弓形虫蛋白酶家族共有5个，包括3个组织蛋白酶Cs，1个组织蛋白酶B和1个组织蛋白酶L。TgCPC1（刚地弓形虫组织蛋白酶1）是速殖子中最高表达的组织蛋白酶，但TgCPC1, TgCPC2和TgCPB在活体裂殖体内并未发现，TgCPC1 和TgCPC2集中构成了速殖子、致密颗粒蛋白的分泌小泡。组织蛋白酶Cs为降解目标蛋白所必须，对弓形虫的生长和分化是很重要，可利用其特异性发展新奇的化学治疗剂［19］。

　　2 分子疫苗的研制及作用机理

    弓形虫疫苗研制经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、分子疫苗和核酸疫苗等发展阶段。试验表明，分子疫苗和核酸疫苗与先前的疫苗相比，显示出诸多优越性：①分子疫苗表达的抗原接近天然构象，抗原性较强；②能诱导机体对抗原的细胞—体液免疫应答；③进行联合免疫：将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将不同抗原基因的多种质粒联合应用，制备多价分子疫苗。目前，已利用DNA重组技术在原核细胞中完成基因的克隆和表达，成功获得大量疫苗。但原核细胞不能修饰蛋白质(如糖基化)，常导致表达产物免疫原性低，可用产生融合蛋白的方法，或给予一种佐剂来“活化”抗原提呈细胞，以增加疫苗的免疫原性。

　　2.1  单价分子—亚单位疫苗 

　　在弓形虫疫苗的研究中，单价分子疫苗的研究比较透彻，其原理是将病原体的单一保护性抗原基因通过原核或真核表达系统表达纯化后制成的疫苗。研究较多的有P30、P22疫苗，司进等［20］扩增SAG1的全长基因，将其亚克隆至原核表达载体pET-32c中，在大肠埃希菌中经IPTG诱导表达出分子量约37 000大小的融合蛋白，亲和纯化的rSAG1具有较强的免疫反应性。在动物实验中，P30单价基因疫苗只能使实验动物产生部分保护性［21］。用P22重组抗原免疫小鼠，可测得高滴度抗SAG2血清IgG抗体。Luden等［22］用P22谷胱甘肽(GST)融合蛋白和GST同时免疫鼠，证实产生了针对融合蛋白和GST的抗体，但用卵囊经口服途径感染鼠，显示对弓形虫攻击无明显的保护作用，考虑与所用虫株、免疫方法及融合蛋白的不同成分如GST等因素有关。亚单位疫苗蛋白诱导的抗体必须具有亲和力、特异性和生物活性，且能足以阻断感染，但到目前为止，由于单一虫体蛋白免疫原性较弱，弓形虫蛋白的免疫原性各不相同，使得单价亚单位疫苗的研究进展缓慢。此外，诱导的免疫应答持续时间不够持久仍是一个难题。

　　2.2  复合多价疫苗 

　　其构建策略是应用基因重组技术等将不同种株或(和)不同生活史时期弓形虫抗原的基因片段(包含T细胞和／或B细胞表位等)组合在一起，接种后能刺激机体产生对不同种株或(和)不同生活史时期的弓形虫均起作用的特异免疫反应，使疫苗具有多用性和可靠的保护性。最近几年，由于数种单价弓形虫疫苗的试验效果均不满意，故国内外专家普遍看好复合多价弓形虫疫苗。目前研究发展了几种类型的复合抗原疫苗：①用重组体或多肽同靶受体随意结合形成一种新抗原；②用能在体外表达原虫不同抗原的质粒DNA；③克隆能表达弓形虫抗原的媒介载体；④用重组蛋白与能增强保护性免疫反应的佐剂结合物。杨婷婷等［23］构建了表达质粒pcDNA3.1-P30 及pcDNA3.1-P30-ROP2,小鼠实验结果表明，复合多价疫苗诱导小鼠抗体水平高于单价疫苗免疫组，证明选自弓形虫不同生活阶段的复合抗原基因免疫效果优于单价基因。另一研究结果表明［24］，低剂量(25μg/鼠)的p30与ROP2复合基因疫苗能使小鼠抵御RH株弓形虫致死性攻击感染，而同一实验中P30或ROP2单价基因低(25μg/鼠) 、高(50μg/鼠)剂量组小鼠均在8d 内死亡，表明P30与ROP2两种基因联合应用确能增强疫苗的免疫效果。对复合多价疫苗的研究尚较薄弱，分别制备两种抗原再联合免疫小鼠，不但操作繁琐，而且不宜得到纯度高的蛋白，不能保证免疫效果。

　　2.3  混合多价疫苗 

　　有学者发现［25］数种弓形虫蛋白联合使用能尽可能多地提供弓形虫抗原表位，用其制成的混合多表位疫苗，能同时诱导机体产生高水平的保护性体液免疫和细胞免疫，如将P35 、P29 、P30蛋白作为混合抗原，用Rec-ELISA方法检测速殖子感染者血清IgG，其敏感度、特异性和符合率分别达到98.4 %、95.7 %和97.2%；P35、P29和P66联用检测速殖子感染者血清IgM，其敏感度、特异性和符合率也分别达到93.1 %、95.0 %和94.5%。陈观今等［26］在SAG1和IL-2基因佐剂混合免疫诱导鼠抗弓形虫感染的研究中，用IL-2细胞因子载体与pcDNA3-SAG1质粒共注射时，可作为佐剂增强细胞免疫反应，包括鼠体内IFN-r的增加，具有明显的重要意义，因为抗弓形虫感染的保护性免疫受IFN-r含量的调节。混合基因疫苗虽有较好的免疫效果，但大量提取及纯化过程较复杂, 且真核细胞接受外源DNA的数量和能力有限。同时，两质粒在体内表达外源蛋白时势必竞争宿主体内的基因转录及表达系统。为解决此缺点，应多加研究，比如可将基因顺序连接于真核表达载体上, 构建弓形虫复合基因疫苗等。

　　3 影响弓形虫疫苗效果的因素

　　3.1 蛋白载体 

　　同一种抗原采用不同的重组表达载体，其表达产物的免疫学特性可存在差异。亚单位分子疫苗难以诱导机体产生免疫应答。为增强其免疫活性，一般将抗原活性表位连于一蛋白载体，其目的在于①蛋白载体的存在可重塑抗原活性短肽的天然构象；② 蛋白载体带有外源性T细胞表位，这些表位与抗原活性表位联合共同诱导机体的免疫应答、可诱导机体产生抗体。

　　3.2 免疫佐剂 

　　可运用佐剂的非特异性作用增强抗原的免疫原性，但具体选择何种佐剂尚需仔细斟酌。有许多已经使用或正在考虑的佐剂，均可作为免疫增强剂，如铝盐及钙盐、矿物油、可代谢脂类、合成脂质体、合成胞壁酰二肽、可经生物降解的多聚物和微生物片断、弗氏佐剂以及短棒杆菌等，与脂质体的磷脂双层结合的蛋白质，也有较强的佐剂作用。

　　3.3 侯选疫苗的保护性预测 

　　寻找有效的保护性抗原是弓形虫疫苗研究的热点。但候选疫苗有时不得不在缺乏了解其保护作用机制、缺乏恰当的检测方法对保护性效果进行预测。这往往导致弓形虫研究有限资金的浪费；另外体外检测候选疫苗的保护性免疫，常采用免疫接种小鼠，以其血清抗体水平变化及外周血细胞的增殖情况进行保护性判断，经动物实验所得结论推测在人体的有效性其可信度又如何呢?所以在确认候选疫苗有必要做保护性预测的同时，发展对有效的保护性检测方法也是重要的。

　　4 弓形虫分子疫苗研制所面临的困难和挑战

    如上所述，弓形虫抗原特异性存在高度变异性、具有多种入侵途径和逃避宿主免疫攻击的机制，这使弓形虫疫苗研制比一般细菌和病毒性传染病疫苗研制更为困难。目前，弓形虫疫苗研制主要存在以下几方面的困难：①缺乏保护作用强的候选抗原。尽管在过去多年中已鉴定了各期的疫苗候选抗原，但能产生强而持久保护性免疫力的抗原仍十分有限；②缺乏对弓形虫保护性免疫机制的了解。抗弓形虫免疫应答的细胞因子有免疫上调因子（IFN-r、 IL-2、TNF-a、IL-1、IL-7、IL-12、IL-15）和免疫下调因子（IL-4、IL-6、IL-10），只有免疫上调因子的高表达与下调因子的低表达达到某种平衡，弓形虫才不能逃避宿主的免疫应答。而目前大多数实验均采用鼠弓形虫模型来研究抗弓形虫免疫机制，由此得出的机制与人体免疫机制并非完全一致；③弓形虫抗原变异及多途径入侵机制。弓形虫抗原不仅具有其特异性，而且存在严重的株间变异，这使弓形虫疫苗研制显得更为复杂和困难；④缺乏持久的免疫力和难以产生足够高水平的抗体。

　　5 展望

    目前研制的弓形虫分子疫苗，多属于单价亚单位疫苗，其免疫效果不理想。选用不同抗原或不同表位制备的多价疫苗，能协同诱导不同免疫杀虫机制杀伤多个发育期的弓形虫，可克服单个抗原分子诱导的免疫保护水平偏低的问题，但同时也存在生产过程复杂，技术难度大及成本高的缺点。今后在弓形虫疫苗的研究工作中，还应着重于对弓形虫保护性抗原的进一步深入研究，继续寻找强有力的保护性抗原；选择合适的佐剂十分重要，需要更加深入的研究；疫苗免疫途径和方法的选择以及评估体系的建立等，有待于作进一步探讨。弓形虫分子疫苗研制更应建立在对其免疫机制、分子结构与功能更全面认识的基础上，随着生物信息技术和基因工程的不断发展，弓形虫分子疫苗的研制势必会取得重大突破。

【参考文献】
  　　［1］El Kouni MH. Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii: potential targets for chemotherapy［J］. CurrPharJ-Teisai Des, 2007, 13(6):581～597.

　　［2］Bhopale GM. Development of a vaccine for toxoplasmosis: current status［J］. Microbes Infect, 2003, 5(5):457～462.

　　［3］Seng S, Makala LH, Yokoyama M, et al. SAG1 is a host-targeted antigen for protection against toxoplasma gondii infection［J］. Pathobiology, 2004, 71(3): 144～151.

　　［4］Dzierszinski F, Mortuaire M, Cesbron-Delauw MF, et al. Targeted disruption of the glycosylpho sphatidylinositol-anchored surface antigen SAG3 gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice［J］. Mol Microbiol, 2000, 37(3):574～582.

　　［5］Lekutis C，Ferguson DJ，Boothroyd JC，et al. Toxoplasma gondii：identification of a developmentally regulated family of genes related to SAG2［J］. Exp Parasitol, 2000, 96(2):89～96.

　　［6］Di Cristina M, Del Polo P, Bufolano W, et al. The Toxoplasma gondii bradyzoite antigens BAG1 and MAGI induce early humoral and cell-mediated immune responses upon human infection［J］. Microbes Infect, 2004, 6(2):164～171.

　　［7］田春林, 石焕焕, 秦小虎, 等. 刚地弓形虫SAG4基因的体外扩增及序列分析［J］. 广西医科大学学报, 2007, 24(2):228～230.

　　［8］张仁利, 吴少庭. 弓形虫p35蛋白的基因克隆及其分子特征［J］. 中国人兽共患病杂志, 2001, 17(4): 24～26.

　　［9］Aubert D，Maine GT，Villena I，et al．Recombinant antigens to detect Toxoplasma gondii-specific immunoglobulin G and immunoglabulin M in human sera by enzyme immunoassay［J］. Clin Microbiol, 2000, 38(11): 1144～1150.

　　［10］Fukumoto S, Xuan X, Inoue N, et al. Molecular characterization of a gene encoding a 29-kDa cytoplasmic protein of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potentiality［J］. Mol Biochem Parasitol, 2003, 131(2): 129～136.

　　［11］Vercammen M, ScoEz T, Huygen K, et al. DNA vaccination with genes encoding Toxoplasma gondii antigens GRA1,GRA7and ROP2 induces partially protective immunity against lethal challenge in mice［J］. Infect Immun, 2000, 68(1): 38～45.

　　［12］Bradley PJ, Boothroyd JC. The proregion of Toxoplasma gondii ROP1 is a rhoptry-targeting signal［J］. Int J Parasitol, 2001, 31(11): 1177～1186.

　　［13］Guo H, Chen G, Zheng H, et al.Immune responses in mice vaccinated with recombinant plasmid pcDNA3 containing ROP1 gene from Toxoplasma gondii［J］. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi, 1999,17(6): 334～337.

　　［14］Roque-Reséndiz JL, Rosales R, Herion P, et al. MVA ROP2 vaccinia virus recombinant as a vaccine candidate for toxoplasmosis［J］. Parasitology, 2004, 128(4): 397～405.

　　［15］Cerede O, Dubremetz JF, Soete M, et al. Synergistic role of micronemal proteins in Toxoplasma gondii virulence［J］. J Exp Med, 2005, 201(3):453～463.

　　［16］余南, 何蔼, 郑小英, 等. 刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的克隆与表达［J］.中国人兽共患病杂志, 2005, 21(4):331～334.

　　［17］江涛, 马立安, 赵俊龙, 等. 弓形虫MIC3蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测［J］. 长江大学学报(自科版)医学卷, 2007, 4(1): 1～4.

　　［18］吴翔, 蒋立平, 舒衡平, 等. 抗弓形虫单克隆抗体免疫筛选弓形虫速殖cDNA文库［J］. 中国人兽共患病杂志, 2004, 20(4): 288～290.

　　［19］Que X, Engel JC, Ferguson D, et al. Cathepsin Cs are key for the intracellular survival of the protozoan parasite, Toxoplasma gondii［J］. J Biol Chem, 2007, 282(7):4994～5003.

　　［20］司进, 汤俊明, 赵松, 等. 刚地弓形虫RH株主要表面抗原1的原核表达和纯化及免疫反应性检测［J］. 中华检验医学杂志, 2004, 27(2 ): 107～109.　

　　［21］Angus CW, Klivington-Evans D, Dubey J P, et al. Immunization with a DNA plasmid encoding the SAG1 (p30) protein of Toxoplasma gondii is immunogenic and protective in rodents［J］. Infect Dis, 2000, 181(1): 317～324.

　　［22］Luden A, Parmley S, Bengtsson KL, et al. Use of a recombinant antigen，SAG2，expressed as a glutathione-s-transferase fusion protein to immunize mice against Toxoplasma gondii［J］. Parasitol Res,1997, 83(1): 6～9.

　　［23］杨婷婷, 何深一, 蒋华, 等. 弓形虫主要表面抗原p30单价及复合基因疫苗的构建［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2005, 23(1): 14～17.

　　［24］Fachado A, Rodriguez A, Angel SO, et al. Protective effect of a naked DNA vaccine cocktail against lethal toxoplasmosis in mice［J］. Vaccine, 2003, 21(13-14): 1327～1335.

　　［25］Aubert D, Maine GT, Villena I, et al. Recombinant antigens to detect Toxoplasma gondii Spe-cific immunoglobulin G and immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassay［J］. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1144～1150.

　　［26］陈观今, 陈海峰, 郭虹, 等. SAG1和IL-2基因佐剂混合免疫诱导鼠抗弓形虫感染的研究［J］.热带医学杂志, 2002, 2(1):1～4.

作者单位：1.广西医科大学病原生物学专业06级硕士研究生,广西 南宁 530021; 2.广西医科大学病原生物学教研室,广西 南宁 530021