HPLC法测定三十六味消渴胶囊中靛玉红的含量

【摘要】  　　目的 建立三十六味消渴胶囊中的靛玉红的HPLC测定方法。方法 以靛玉红对照品作对照，采用HPLC法测定三十六味消渴胶囊中的靛玉红含量。色谱柱：依利特色谱柱C18 SinoChrom ODS-BP 5μm(4.6mm.I.D.×200mm)；检测波长：280nm；流动相：0.02mol/L磷酸二氢钠溶液－甲醇（22：78）;柱温：40℃；进样量：10μl，采用外标法。结果 在优化色谱条件下，三十六味消渴胶囊中的靛玉红线性范围0.02148～0.5370μg，r=0.9997,回归方程为：A=4783.6449C-24.4227,含量测定的回收率为：98.18%,RSD=0.89%。结论 所建立的方法专属性强，操作简便，结果准确，重现性好，适用于对三十六味消渴胶囊中的靛玉红含量的测定。

【关键词】  高效液相色谱法；靛玉红；三十六味消渴胶囊；含量测定

　　Determination of contents of indirubin in Xiaoke capsules made from 36 medicinal herbs.

　　CHANG Yi-ding, LUAN Guo-hua, LI Li-dong. 

　　1.Affiliated Hospital of Beihua University, Jilin 132000, Jilin, P. R. China;

　　2. Jilin Municipal Institute for Drug Control, Jilin 132001, Jilin, P. R.China

    Abstract：Objective  To established a high performance liquid chromatography for determination of indirubin content.  Methods  The indirubin in Sanshiliuwei Xiaoke capsule was determined with HPLC. According to Litt C18 padding:SinoChrom ODS-BP 5μm; SIZE：4.6mm.I.D.×200mm；the wavelength was 280nm;0.02mol/L Sodium Dihydrogen Phosphate-Disodium hydrogen methanol(22:78)as the mobil phase.  Results  The range of curves of indirubin was 0.02148～0.5370μg in sanshiliuwei xiaoke capsule,r=0.9997,Regression equation was A=4783.6449C-24.4227,The recovery of determination was 98.18%,the RSD was 0.89%.  Conclusion  The method is special, simple and convenient, the result is accurrate and reproducible, it is suitable for the determination of indirubin of the Sanshiliuwei Xiaoke Capsule.

    Key words：HPLC; Indirubin;Sanshiliuwei xiaoke Capsule; Quantitative determination

    三十六味消渴胶囊由西洋参、麦冬、熟地黄、红参、黄芪、青黛［1］等三十六味药组成。其作用包括［2］：抑制蛋白质糖基化，改善微循环障碍、抑制脂肪过量分解，治疗脂肪的合成障碍，抑制醛糖还原酶活性，对神经病变导致的手足麻木、刺痛、足部的溃疡坏死等症状，还可改善伤口不愈的现象和可降低生化药物对胰岛细胞的损伤，使胰岛素与受体的亲和力提高，使血糖保持稳定。临床上适用于气阴两虚症糖尿病的治疗,可改善倦怠乏力,多食易饥,烦渴多饮,口干舌燥,尿频量多等症状。

    三十六味消渴胶囊为降血糖类中成药制剂。法定标准［3］：（国家药监局药品标准）中靛玉红的含量采用双波长薄层色谱扫描法测定，操作烦琐，含量测定结果重现性差。为提高质量控制方法。本文采用HPLC法对三十六味消渴胶囊中靛玉红的含量进行测定。国内外未见报道。该法实验简便、快速，结果准确、可行。现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　高效液相色谱仪：Agilent 1100 LC（包括   脱气机、四元泵、G1313A serial# DE3322926 自动进样器、柱温箱、 DAD检测器）电子天平（Sartorius  Bp211D型）超声清洗器（KQ-400KDB型），真空泵（SHB-Ⅲ型），UV-2450型紫外分光光度计（日本岛津公司）甲醇（色谱纯，加拿大L7G 4R9公司）、磷酸二氢钠（分析纯 ）、三氯甲烷（分析纯）、甲醇（分析纯）、重蒸馏水。靛玉红对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用），三十六味消渴胶囊（生产批号：060223 060221 060222）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  色谱条件 

　　色谱柱：色谱柱C18 SinoChrom ODS-BP5μm（4.6mm×200mm），检测波长：280nm流动相：0.02mol/l磷酸二氢钠溶液－甲醇（22：78）柱温：25℃进样量：10μl  流速：1.0ml/min。

　　1.2.2  检测波长的确定 

　　据文献报道青黛的其他制剂中靛玉红的测定在292nm处有最大吸收［6～8］，而 靛玉红HPLC法测定多采用检测波长为280nm［4,5］。为选择检测波长我们取靛玉红对照品精密称定0.00537g，用三氯甲烷溶解稀释至浓度为21.48μg/ml的溶液，用紫外分光光度计在240～350nm扫描，结果靛玉红对照品在292nm 附近有最大吸收。结合文献报道，我们采用两个波长（280nm、292nm）进行比较，结果在280nm、292nm处的峰面积基本相同，而在280nm处的重现性最好，所以选择280nm作为高效液相色谱法测定三十六味消渴胶囊中靛玉红含量的检测波长。
   
　　取本品40粒的内容物，精密称定，研细，混匀，精密称定约5g，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流8h［3］，倾出提取液，用适量三氯甲烷-甲醇（1：1）混合溶液洗涤烧瓶，洗涤液与提取液合并，蒸干，残渣加三氯甲烷-甲醇（1：1）溶液适量使溶解，移至2.5ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。进样10μl，其色谱图见图1。

　　1.2.3  对照品溶液制备为标准曲线绘制 

　　精密称定20℃干燥至恒重的靛玉红对照品0.00537g，加三氯甲烷制成每1ml含21.48μg的溶液，滤过（滤膜），即得。自动进样测定。结果无其它干扰，色谱条件符合要求。

　　靛玉红对照品溶液适量，再设置Agilent 1100 高效液相色谱仪自动精密量取上述溶液各、1、2.5、5、10、15、20、25μl注入色谱仪中，记录峰面积，并以靛玉红对照品的峰面积为纵坐标，以其进样量为横坐标，进行线性回归。（r=0.9997）结果表明：靛玉红对照品溶液在0.02148～0.5370μg范围内线性关系良好,回归方程A=4783.6449C-24.4271。结果见表1。表1  标准曲线的实验结果（略）

　　2 结果

　　2.1  精密度试验 

　　取1.2.2项中浓度为21.48μg/ml的靛玉红对照品溶液适量，照标准曲线绘制中含量测定方法，设置自动进样10μl，重复进样5次，记录峰面积，RSD= 0.89%。结果见表2。表2  精密度的实验结果（略）

　　2.2  稳定性试验 

　　取1.2.2供试品溶液，装于色谱仪中，并设置于0、2、4、8、12、24h分别自动进样10μl，记录峰面积，试验结果RSD=1.29%，表明供试品溶液在24h内是稳定的。

　　2.3  回收率试验 

　　取已知靛玉红含量的三十六味消渴胶囊5份，分别加入等量靛玉红对照品溶液，按供试品中靛玉红含量测定方法测定，每份平行测定3次，计算回收率结果见表3。表3  回收率实验结果（略）

　　2.4  重现性实验 

　　取同一批号（批号060223）的三十六味消渴胶囊约适量，按1.2.2项下方法配制供试品溶液，取上述溶液各10μl，依法重复测定5次，结果见表4。表4  重现性实验的实验结果（略）

　　2.5  样品测定

　　取三十六味消渴胶囊3批，分别精密称取适量，依法配制供试品溶液，取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪按外标法计算含量（n=5）结果见表5～6。表5  对照品测定结果（略）表6  供试品测定结果（略）注：法定方法为双波长薄层色谱扫描法（国家药品监督管理局标准试行），其规定每粒靛玉红含量不得少于1.0μg。

　　3  讨论

　　3.1  测定波长的选择 
　
　　我们对靛玉红对照品溶液在200～350nm波长范围内进行了光谱扫描，结果：靛玉红在292nm处有最大吸收峰，以280nm灵敏度最高，为了满足分析的要求及保证分析精度，我们采用多个波长对靛玉红进行测定，试验表明靛玉红在280nm处测定结果适宜。

　　3.2  流动相的选择 

　　我们分别采用三种流动相进行筛选，结果发现流动相中甲醇的浓度对靛玉红的保留行为影响很大，随着有机相比例的增大，保留时间明显提前。通过调整流动相的比例，最后选定0.02mol/L磷酸二氢钠溶液－甲醇（22：78）为流动相，在较短时间内，使供试品溶液中靛玉红与其它组分能够达到基线分离，溶剂亦无干扰。

　　3.3  稳定性考察 

　　靛玉红在常温24h内基本稳定。此外，光对靛玉红影响也很大，样品在整个实验过程中尽量避光操作。

　　3.4  采用HPLC法测定三十六味消渴胶囊中靛玉红的含量与法定方法比较，结果无差异。该法实验简便、快速，结果准确、方法可行。

【参考文献】
  　　［1］青黛中靛玉红的含量测定［M］.中国药典，北京:化学工业出版社,2005，138.

　　［2］杨军,王京霞. 反相高效液相色谱法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量［J］.中药新药与临床药理，1996，7(2)：43～44.

　　［3］三十六味消渴胶囊中靛玉红的测定［S］.国家药品监督管理局标准试行.WS-5647（B-0647）,2002-12-1

　　［4］王素娥,宁微微. RP-HPLC 法测定板蓝根浸膏中靛蓝、靛玉红的含量［J］.河北大学学报（自然科学版）,2005,25(5):58.

　　［5］税丕先,庄元春,朱烨,等.反相高效液相色谱法测定板蓝根注射液中靛玉红的含量［J］.时珍国医国药， 2005,3（10）:128.

　　［6］曹红,秦红霖. 高效液相色谱法测定复方青黛片中靛蓝和靛玉红的含量［OL］.中国色谱网2003年.

　　［7］韩光,孙茂峰,王荔. HPLC测定板蓝根含片中靛玉红的含量［J］.西北药学杂志,2003,18（5）:202～203.

　　［8］杨军，王京霞.反相高效液相色谱法测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量［J］.中药新药与临床药理，1996，7(2)：43～44.

作者单位：1. 北华大学附属医院,吉林 吉林 132000; 2.吉林市药检所,吉林 吉林 132001.