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【摘要】 目的 探讨支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者人β防御素-2(hBD-2)的表达。方法 采用RT-PCR法对10例患者皮损hBD-2mRNA检测，并以10例正常组织做对照。结果 正常人和患者均可检测到hBD-2mRNA表达，但支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者表达比明显增多。结论 hBD-2参与了支原体性宫颈炎发病过程。
【关键词】 支原体；HBD-2；宫颈炎
Expression of human β-Defensin-2 (hBD-2) mRNA in mucosa of cervicitis patients due to Mycoplasma infection.
REN Xiao-li, CHEN Jin-guang.
Taizhou Municipal People’s Hospital, Taizhou 318000,Zhejiang, P.R.China
Abstract：Objective To investigate expression of human β-Defensin-2 (hBD-2) mRNA in mucosa of cervicitis patients due to Mycoplasma infection. Methods The expression of hBD-2 mRNA in 15 cervicitis patients infected with Mycoplasma was investigated by using RT-PCR and the results were compared with 10 normal controls. Results Human beta-defensin 2 mRNA was expressed in all cervicitis with Mycoplasma infection. Conclusion HBD-2 might be involved in the pathogennesis of cervicitis in patients with mycoplasma infection.
Key words：Mycoplasma; Cervicitis; hBD-2 Gene
性传播疾病是一组危害极大的疾病。非淋菌性宫颈炎在临床上也非常常见,大部分是由支原体、衣原体感染引起,造成的危害也很大，甚至导致不孕不育。所以，如何及时有效的治疗非淋菌性宫颈炎尤为重要。笔者就支原体感染引起的宫颈炎患者粘膜HBD-2mRNA的表达进行研究，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者10例，用培养法证实并排除真菌、衣原体、病源性细菌、滴虫感染。年龄26～40岁，平均年龄(32.5±6.9)岁；对照组正常妇女10例，取自同时段体检者，年龄27～38岁，平均年龄(31.1±6.2)岁。
1.2 方法
1.2.1 取材
用泌尿生殖道内窥镜配合活检，从炎症或正常粘膜取直径5mm样本80～100mg左右，立即投入液氮并浸透完全，冻存于-80℃。
1.2.2 总RNA提取及RT-PCR分析
采用Trizol试剂盒(编号：Lot#035A)按操作指南从组织中提取总RNA，紫外分光光度法鉴定其纯度，甲醛变性电泳测定其完整性。
以提取的RNA为模板，采用上海生工生物工程技术服务公司的一步法RNA-PCR试剂盒（SK2442，#0302），所用特异性引物根据GeneBank的人β防御素2 cDNA序列设计(参考国外相关论文设计)，并由上海华大基因上海鼎安生物公司合成。HBD-2上游引物为：5’-cagccatcagccatgagggtc-3’，下游引物为：5’-ggagccctttctgaatccgca-3’，其产物为246bp，约为250bp。用内参照β-actin特异引物作RT-PCR，引物由上海华大基因公司合成。反应条件：在40℃ 60min，95℃ 5min，然后94℃预变性2min，进行35个循环，94℃ 50s，57℃ 30s，72℃ 45s。最后在72℃延时7min。
1.2.3 RT-PCR产物定量
10μl RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，摄像，与预计扩增片段大小比较，各RT-PCR产物特异性测序证实。通过光密度扫描仪扫描图像并进行分析，分别测定hBD-2与β-actin灰度的相对比值，以相对灰度<0.1为阴性。
1.3 统计学方法
方差齐性检验，两均数用t检验。
2 结果
2.1 在正常组和支原体感染组子宫颈粘膜膜中HBD-2基因均有表达
但两组的HBD-2基因表达有明显差异(图1)，支原体感染组HBD-2基因表达比正常组强得多，其相对灰度经统计学t检验处理有显著性差异（表1）（P<0.001）。
2.2 两组子宫颈粘膜HBD-2 mRNA平均相对灰度比较
正常组HBD-2 mRNA平均相对灰度为0.118±0.023,支原体感染组HBD-2 mRNA平均相对灰度为0.210±0.020，两组差异有统计学意义（P<0.01)。
3 讨论
目前对于性病所致不孕不育症的防治，主要是预防和消除致病微生物，减轻炎症，减少感染后遗症，防止引起机体免疫功能失调及抗精子抗体等的产生，从而达到防治不孕不育的目的。非淋菌性宫颈炎在临床上极为常见，以支原体感染更为多见。当致病微生物进入后尿道或宫颈，向上蔓延引起泌尿生殖道和附近器官炎症，如输卵管炎、子宫内膜炎、卵巢炎等，可长期潜伏在腺组织深部，成为慢性炎症而反复发作，促使其他病原微生物易于定植、感染而不利于精子存活，使粘膜细胞坏死，输卵管纤毛运动停滞，同时粘膜坏死后由鳞状上皮或结缔组织代替，引起输卵管狭窄、梗阻，导致不孕，给患者造成极大的痛苦。
防御素（Defensin）是近年来发现的一组富含半胱氨酸阳离子小分子抗菌多肽，位于8p23染色体上，终体为含41个氨基酸序列的小分子多肽，相对分子质量为4328.3。其分子中都带有较多的正电荷，肽链折叠形成三束β片层结构，由6个半胱氨酸残基形成三个二硫键稳定其结构，分子中均富含精氨酸。目前在人类已证实存在两类内源性的防御素：α-防御素和β-防御素，人β防御素-2（HBD-2）是人体非特异性免疫系统的一种非常重要的内源性抗微生物肽，在防御病原微生物侵袭和炎症中起着重要作用。在正常皮肤粘膜中浓度低并不能发挥抗菌作用，而在炎症损害或肿瘤中其表达成倍增加并表现高效的抗菌作用和抗肿瘤作用［1,2］。在培养的角质形成细胞中发现, 它主要聚集在细胞的板层小体中。HBD-2有广谱高效抗G-、G+菌、真菌、某些衣壳病毒、支原体的活性，且未见有耐药性［3］。高等动物细胞则由于细胞膜中负电荷含量较低而免于受到攻击。
笔者应用RT-PCR技术，检测支原体性宫颈炎粘膜HBD-2mRNA的表达，发现HBD-2呈高表达［4］。它的调节机制现在一般认为属于炎症可调性多肽，在正常机体的上皮粘膜组织表面的化学屏障系统中含有微量的HBD-2，当这种屏障受到损害（如细菌、真菌、支原体等）时，细菌及产物与PPRRs受体结合，并在多种炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-2等）参与下，与HBD-2基因启动子区域存在数个转录因子NF-κB和IL-6的结合位点结合，通过细胞内信号转导机制使转录因子活化，从而成倍地增加它的表达。也有研究提示［5］, 它可能促使肥大细胞向炎症部位聚集，从而诱导特异性免疫的发生。笔者认为，支原体性宫颈炎粘膜HBD-2mRNA高表达并未有效的抑制局部炎症，推测皮损局部HBD-2功能活性不足，其功能的失活可能与病原微生物定植、集落于皮肤和粘膜上皮而导致严重的感染关系密切。通过调节HBD-2的效能有望成为临床治疗的新策略。
【参考文献】
［1］Emmanuelle Com et al. Expression of antimicrobial Defensins in the Male Reproductive Tract of rats, Mice, and Humans Biology of reproduction, 2003,68(1):95～104.
［2］Park K et al. Expression of beta-defensins in human middle ear cholesteatoma［J］. Acta Otolaryngol, 2003,123(2):p236～240.
［3］Oren A et al. In human epidermis, beta-defensin 2 is packaged in lamellar bodies Exp Mol Pathol, 2003,74(2):p180～182.
［4］Hoover DM et al. The structure of human beta-defensin-2 shows evidence of higher order oligomerization［J］. J Biol Chem, 2000,275(42):p32911～32918.
［5］Duits LA. Expression of beta-defensin 1 and 2 mRNA by human monocytes, macrophages and dendritic cells［J］. Immunology, 2002, 106(4):p517～525.
作者单位：台州市立医院皮肤科,浙江 台州 318000.