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【摘要】 目的 克隆弓形虫RH株Calpain（依钙蛋白酶）-like基因，分析免疫生物学功能，筛选预防弓形虫感染的疫苗候选分子。 方法 利用人类、鼠类和其它寄生虫的Calpain基因同源性比较的保守区域合成混合引物，以弓形虫的RNA为模板，应用RT-PCR扩增弓形虫Calpain-like基因片段，扩增的片段通过TA克隆插入克隆载体pET32A，筛选阳性克隆进行双酶切鉴定和DNA序列分析，用克隆的基因片段制备特异性基因探针，经Northern blot 技术证实弓形虫Calpain-like基因mRNA。 结果 RT-PCR扩增了316bp弓形虫Calpain-like基因, 其DNA序列与日本血吸虫Calpain基因同一区域的同源性为70%，与计算机推测的弓形虫Calpain-like基因的同源性为100%。Northern blot显示了弓形虫Calpain-like基因mRNA的大小约6 300bp。 结论 弓形虫RH株基因组中存在Calpain-like基因, Calpain-like基因在弓形虫RH株中高度表达。
【关键词】 弓形虫; Calpain（依钙蛋白酶）-lik; 基因克隆; RT-PCR
Cloning and biological characteristic of calpain-like gene of Toxoplasma gondii.
CHEN Xue-yan, FU Yu-cai, LI Lu, et al.
1. Shenzhen Municipal Center for Diseases Control and Prevention, Shenzhen 518020;
2. Medical College of Shantou Universtity, Shantou 515063, Guangdong, P. R. China
Abstract：Objective To investigate molecular characteristics and biological properties of calpain-like gene from Toxoplasma gondii RH strain for future screening of calpain vaccine candidates and target of drug prophylaxisby molecular cloning of this enzyme from Toxoplasma gondii RH strain. Methods RT-PCR and TA cloning technique were used to clone the fragment of calpain-like gene and then prokaryotic expression vector pET32A containing the fragment of calpain-like cDNA was constructed by recombination techniques. Then specific genetic probe was prepared with the genetic fragment rooectly screened after enzymatic digestion and sequence analysis. Calpain-like mRNA was confirmed by Northern blotting. Results Calpain-like 316bp gene was cloned successfully by RT-PCR. The homology of of nucleotide sequence and amino acid sequence of calpain-like 316bp gene with Schistosoma japonicun was 70%and 100% with Toxoplasma gondii, respectively. Expression of calpain-like mRNA was investigated with a oligonucleotide probe corresponding to nucleotide positions of 6 300bp. Conclusion The calpain-like gene has been successfully expresssed in Toxoplasma gondii RH strain.
Key words：Toxoplasma gondii；Calpain-like；Gene cloning；RT-PCR
弓形虫是一种分布广泛的、专性细胞内寄生的机会致病性原虫，可感染人及多种动物的有核细胞。估计全球有5～10亿人受感染，我国弓形虫感染人群至少也有6千万，所幸多数为隐性感染［1］。弓形虫感染人体后可侵犯多种脏器和组织，并可通过母婴垂直传播而造成胎儿畸形、神经系统发育障碍、脉络膜视网膜炎等，引起流产、早产甚至死胎；对免疫功能低下及艾滋病的患者常是致死的主要病因。弓形虫病已成为一个严重的、世界性的公共卫生问题［2］。筛选抗弓形虫感染的疫苗候选分子，对有效控制弓形虫感染、提高人口素质，具有重要的现实意义。
蛋白酶是一类降解蛋白的水解酶。依据酶活性中心起关键作用的催化集团，分丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、门冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶四种，蛋白酶在组织细胞内活性蛋白的加工成熟、多余蛋白的分解中起重要作用，抑制机体蛋白酶的活性将导致机体某些生物活性的丧失，甚至代谢障碍、发育受阻等［3～5］。国内外研究证明，钙离子激活的蛋白激酶在弓形虫发育和入侵宿主细胞中起重要作用。日本血吸虫、曼氏血吸虫Calpain基因的重组疫苗在小鼠的动物模型中具有抗感染的保护作用，其作用机制得到了初步的阐明［6］。研究弓形虫Calpain-like的生物学功能，探讨Calpain-like在弓形虫感染中的作用，为筛选抗弓形虫感染的疫苗候选分子提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 弓形虫株
RH株弓形虫为本室液氮保种，复苏后腹腔接种BALB∕c鼠传代。取感染后3d的BALB∕c鼠腹腔液，生理盐水4 000rpm、5min离心沉淀，洗涤两次［7］；实验动物BALB∕c鼠50只，5～6周龄，雌雄不拘，购自广东省实验动物中心。
1.1.2 主要化学试剂
RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit）、反转录试剂盒购自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、质粒抽提试剂盒购自天根生化公司；d NTP,PCR产物纯化试剂盒购自Promega公司；核酸共沉剂、EcoRⅠ、BamHⅠ 限制性内切酶和PCR marker购自Takara公司；RNA Ladder购自晶美公司；DIG探针标记试剂盒、DIG Wash and Block Set 及DIG Easy Hyb购自Roche公司；0.45μm Immobilon-Ny chad Nylon membrane购自Millipore公司；DEPC(焦碳酸二乙酯)、MOPS（吗啉代丙烷磺酸）、去离子甲酰铵购自BBI公司；无水乙醇、氯仿、醋酸钠均为国产分析纯。饱和酚、琼脂糖购自Sangon公司，
1．2 方法
1．2．1 弓形虫RH株速殖子总RNA的提取及引物
总RNA的提取按试剂盒说明进行，用核酸 蛋白分析仪（Eppendorf）测定样品的OD260和OD280值，估算RNA纯度及含量，依据需要使用核酸共沉剂浓缩总RNA，终浓度达到4μg∕μl。总RNA保存于-80℃备用。
1．2．2 PCR扩增行虫RH株Calpain（依钙蛋白酶）-like基因和弓形虫看家基因β-actin
根据GenBank其它已知calpain序列与弓形虫比对设计引物（上游引物: 5'-CGTGGGCGACTGCTCCTTTCTCT-3’,下游引物：5'-CCATTTGGGATCTTTGACGACCTC-3’）.同时以弓形虫看家基因β-actin为内对照(上游引物：5'-CTCACGGAAGCCCCACTCAACC-3’下游引物：5-CTCAGCCGCCTTCATTTCCTCGTC-3’)。引物由上海Invitrogen公司合成。取1μg总RNA使用随机引物经逆转录酶合成cDNA。以cDNA为模板，根据已设计引物、0.1单位Taq DNA聚合酶，加水至总体积为50μl,置Eppendorf PCR仪，在下列条件下扩增：94℃ 9min, 94℃ 45Sec,56℃ 1min,72℃ 1min, 72℃ 7min,共30个循。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察、记录。同时以看家基因β-actin为内对照。
1．2．3 质粒的转化和酶切鉴定
目的基因片段经T4连接酶连接至载体pGEMT-vector，1h后连接产物转化入感受态细胞，冰上放置0.5h，42℃热击90s,加入200μl预热至37℃的LB液体培养基，37℃培养45min后涂布于加有Amp的LB琼脂平板，37℃培养16h。挑取新鲜单菌落接种于3ml的LB培养基中37℃增菌培养16h。小量提取质粒进行酶切鉴定，阳性菌液进行DNA测序。
1．2 .4 地高辛杂交及显色［8,9］
(1)基因组RNA变性：将经变性剂变性后的弓形虫总RNA沸水浴5min后，立即冰浴10min。（2）点膜：采用手工点膜，80℃热固定。（3）地高辛杂交：探针热变性5min,冰浴10min，加入杂交液中。膜置入塑料袋中，加入杂交液和探针。赶走气泡，封口。在65℃杂交炉中杂交16h。（4）洗膜：用洗脱液洗膜后加入封闭液封闭30min,加入地高辛抗体反应30min,洗脱液洗膜。（5）显色：在1×稀释液中平衡2min,加入NBT/BCIP,混匀，避光显色30min。
1.2.5 Northern blot
（1）基因组RNA变性：将经变性剂变性后的弓形虫总RNA沸水浴5min后，立即冰浴10min。（2）电泳：变性RNA在变性胶中电泳6h（3）转膜：采用上行毛细管转移法，室温下转移4h左右。（4）地高辛杂交：探针热变性5min,冰浴10min，加入杂交液中。膜置入塑料袋中，加入杂交液和探针。赶走气泡，封口。在65℃杂交炉中杂交16h。（4）洗膜：用洗脱液洗膜后加入封闭液封闭30min,加入地高辛抗体反应30min,洗脱液洗膜。（5）显色：在1×稀释液中平衡2min,加入NBT∕BCIP，混匀，避光显色3h。
2 结果
2．1 弓形虫Calpain（依钙蛋白酶）-like基因的RT-PCR扩增
依据本文设计的引物，经35个循环扩增得到的弓形虫Calpain-like基因片段，PCR产物经1.5%的琼脂糖电泳可见316bp左右片段，与预期相符。见图1。
2．2 ET32A-Calpain-like酶切鉴定
以菌液上清液为模板进行PCR扩增初步鉴定,目的基因片段316bp,再以限制性内切酶EcoRⅠ酶切质粒pET32A-Calpain-like，获Calpain-like编码基因片段。图2显示，片段与预期值相符。
2．3 探针特异性的鉴定
Calpain-like cDNA基因和β-actin两种探针与弓形虫RNA 杂交呈阳性，图3A为Calpain-like cDNA基因探针与弓形虫来源的总RNA杂交呈阳性，而和其它来源的总RNA杂交结果呈阴性(结果未显示)。因此证明所制备的探针是特异性的，可以用于Calpain-like和β-actin基因的鉴定。
2．4 弓形虫calpain蛋白mRNA Northern blot
总RNA在甲醛变性琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳完成后，用向上毛细管法将RNA转移到尼龙膜上并进行紫外交联固定，再分别与基因探针杂交过夜，最后用免疫学方法进行检测。结果显示Calpain-like基因的显色位置大概在6 300bases左右。β-actin基因的显色位置大概在1 300bases左右。如图4所示为Northern blot的结果。
3 讨论
Calpain是一种钙离子激活的中性蛋白酶。国外研究证明，蛋白酶在弓形虫发育和入侵宿主细胞中起重要作用。研究蛋白酶在弓形虫感染中的作用，既可鉴定出弓形虫感染中的关键蛋白酶，又可筛选出抑制弓形虫感染蛋白酶抑制剂，从而为弓形虫的药物蛋白质组研究提供依据。
弓形虫病的传统治疗方法是以乙胺嘧啶与磺胺嘧啶合用为主，虽取得一定疗效，但其用量大、疗程长、毒副反应发生率高，而对于弓形虫脑炎及免疫缺陷病人不能耐受长期治疗，停药后复发率高，故根治效果差。近年来，弓形虫病的治疗随着临床患者的不断增多和相关问题的客观需求，已越来越引起医务人员的广泛重视［10］。有学者认为，蛋白酶抑制剂治疗寄生虫病是传统治疗方法的一种补充途径。
RNA Dot Blot(RNA点杂交)技术是将RNA点样于滤膜上并进行固定，然后与特异的探针杂交，最后用免疫学检测方法或放射自显影方法进行检测。该方法操作简单，费时比较少，可用于鉴定特定基因的表达量。该技术作为Northern blot的预试验，以确定核酸探针及总RNA的用量。
Northern blot 是最基本、最常用的分子生物学技术之一，它是指将RNA变性并进行电泳分离，再将其转移到固相支持物尼龙膜或硝酸纤维素膜上，然后用液相中标记的cDNA探针进行杂交的过程，以鉴定其中特定mRNA分子的量与大小。该方法是研究基因表达的最严谨的方法之一，其应用十分广泛，常用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异及病理研究。
本研究应用RNA点杂交和Northern blot技术对弓形虫Calpain-like基因的特异表达和基因长度进行了深入的研究，结果表明该基因确为弓形虫特异表达的基因，其大小在6 000bases左右。
蛋白酶抑制剂作为疾病治疗药物的应用已有报道。门冬氨酸蛋白酶抑制剂已用于HIV感染的治疗；金属蛋白酶抑制剂已进入癌症治疗的三级临床观察。丝氨酸蛋白酶抑制剂有望用于肺部及过敏性疾病的治疗。半胱氨酸蛋白酶抑制剂可用于疟疾、锥虫病、利什曼病等的治疗。所以，弓形虫重要蛋白酶及其特异抑制剂的发现和被鉴定，将为弓形虫病的防治提供新的手段，为筛选抗弓形虫感染的疫苗候选分子提供依据。
【参考文献】
目的 克隆弓形虫RH株Calpain（依钙蛋白酶）-like基因，分析免疫生物学功能，筛选预防弓形虫感染的疫苗候选分子。 方法 利用人类、鼠类和其它寄生虫的Calpain基因同源性比较的保守区域合成混合引物，以弓形虫的RNA为模板，应用RT-PCR扩增弓形虫Calpain-like基因片段，扩增的片段通过TA克隆插入克隆载体pET32A，筛选阳性克隆进行双酶切鉴定和DNA序列分析，用克隆的基因片段制备特异性基因探针，经Northern blot 技术证实弓形虫Calpain-like基因mRNA。 结果 RT-PCR扩增了316bp弓形虫Calpain-like基因, 其DNA序列与日本血吸虫Calpain基因同一区域的同源性为70%，与计算机推测的弓形虫Calpain-like基因的同源性为100%。Northern blot显示了弓形虫Calpain-like基因mRNA的大小约6 300bp。 结论 弓形虫RH株基因组中存在Calpain-like基因, Calpain-like基因在弓形虫RH株中高度表达。
作者单位：1.深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020； 2.汕头大学医学院，广东 汕头 515063.