梅毒螺旋体青霉素结合蛋白的克隆及表达

【摘要】  目的 体外克隆并表达梅毒螺旋体青霉素结合蛋白，为制备预防性疫苗奠定基础。 方法 利用PCR反应及基因重组技术，扩增重编码青霉素结合蛋白的基因，构建重组质粒pETJKM/TpN47，IPTG诱导表达。 结果 PCR法扩增出了1 350bp的目的片段，原核表达质粒pETJKM/TpN47酶切鉴定正确，测序结果与Gengbank上公布的基因序列完全一致，并可在大肠杆菌中高效表达。 结论 成功构建了人pETJKM/TpN47原核表达载体，高效表达了青霉素结合蛋白，为梅毒的预防性疫苗的制备以及进一步研究其血清学诊断试剂奠定了基础。

【关键词】  梅毒螺旋体；聚合酶链反应；基因克隆；基因表达

梅毒螺旋体(Treponema pallidum subsp. pallidum, TP)又称苍白螺旋体，其体外培养至今尚未成功，正因如此，人们对TP的基础研究，实验室诊断及疫苗的研究等受到颇大影响。由随着梅毒全基因组测序工作的完成，使人们能够通过生物信息学方法预测特异性和敏感性均高的重组抗原，以便用于梅素的抗体检测以及疫苗的制备［1］。
   
　　为此，本研究拟构建TP47KD基因(TpN47)表达载体，获得高效表达，为进一步研究梅毒基因预防性疫苗提供实验基础。现将结果报告如下。

　　1  材料和方法

　　1．1  材料  梅毒螺旋体Nichols株为新疆维吾尔自治区疾病控制中心董永慧主任技师惠赠，克隆表达载体pET22b (Novagen)、RosettaTM(DE3)plysS(Cam+)菌株、EcoliBL21(DE3)plysS和BL21TMstar(DE3)菌株为我们实验室保藏。质粒提取试剂盒、λDNA/HindIII Marker、NcoI 、XhoI、Expand TMTaq聚合酶、dNTP 、T4 DNA  Lagase、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖（X-gal）、 异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）等为大连宝生生物技术公司产品。

　　1．2  方法

　　1．2．1  引物的设计与合成  根据Genebank发表的TpN47基因序列，设计一对引物如下：引物1：5-TCTGCCCATGGTGAAAGTGAAATACGCACTA-3，引入BamHⅠ酶切位点；引物2: 5-GCTCTCTCGAGCTGGGCCACTACCTTCGC-3，引入Hind Ⅲ酶切位点。由上海生工有限公司合成。

　　1．2．2  克隆表达载体的构建  Primer1和Primer2各5μl（10pmol/μl），2mM dNTP 5μl，10×PCR buffer 10μl，TP DNA 10μl，ExpandTMTaq酶2.5U(1μl)，无菌无离子水67μl，混匀后快速离心后，加入30μl无菌石蜡油共100μl。同时设置一个LP DNA阴性对照和不加TP DNA模板的空白对照管。经94℃ 4min,94℃ 30s,45～65℃ 30s,72℃ 2min,30个循环，最后72℃延伸5min。进行目的基因TpN47扩增。TpN47基因PCR产物的纯化见文献［2］。TpN47基因与pET-22b载体分别10μl、10×buffer H 2μl、NdeⅠ、SalⅠ各1μl 、无菌无离子水6μl，37℃ 5h。TpN47基因与pET-22b载体回收产物17μl、分别17μl、10×T4Ligase buffer 10μl，T4Ligase 1μl（1U/μl）16℃ 5h连接。

　　1．2．3  重组体的转化  取4℃放置20h(或-80℃取出感受态细菌立即溶化后)保存管两支，立即放置冰浴中，取实验组（连结反应物）10μl和对照组（质粒40ng），分别加入200μl感受态细菌中，轻弹混匀后置于冰浴30min，取出置42℃热休克90S（不摇），取出后迅速放回冰浴中，将细菌冷却2min，加入800μl SOC培养基，37℃ 225r/min震摇培养90min，让细菌质粒表达抗生素抗性蛋白。

　　1．2．4  转化菌DH5α筛选  取含氨苄青霉素100μg/L的SOB固体培养基(琼脂为1.5%)均匀涂布20ng/ml的X-gal 40μl和200mg/ml的IPTG 4μl，37℃放置2h左右，待溶液完全吸收，取200μl转化菌液，均匀涂布于平板表面，37℃培养30min后，倒置平板继续培养12h，以灭菌牙签随机挑取10个白色菌落，分别接种于5ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100g/ml)中，37℃ 200r/min震摇培养过夜。

　　1．2．5  重组体PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定  重组体PCR鉴定酶 切鉴定见目的基因TpN47的扩增，酶切鉴定见TpN47基因与pET-22b载体双酶切，重组体序列测定采用正向引物和反向引物测序，委托由上海生工有限公司完成。

　　1．2．6  重组体的诱导表达  取单个菌落接种于5ml LOC液体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃ 200r/min震摇培养过夜，再取50μl新鲜培养过夜菌液，加入5ml含氨苄青霉素100μg/ml另一LOC培养基中，37℃ 200r/min震摇培养3h至对数生长期，取1ml培养菌液作对照（未诱导），剩余的培养基中加入IPTG至终浓度为0．3mM后，37℃ 200r/min震摇培养，分别于1、2、3和4h收集培养菌液各1ml于离心管中。4℃ rmp离心2min，弃上清，收集培养体经超声波破碎菌体后，于4℃ 1 000rmp离心15min，分别取少量上清和沉淀加入等体积2×加样缓冲液，100℃煮沸5min，取15μl进行SDS-PAGE电泳检测表达产物。

　　1．2．7  重组体表达产物检测  取诱导表达的大肠杆菌各30μg（湿重），加入90μl裂解液，0.24μl 50mmol/LPMSF和2.4μl溶菌酶(10mg/ml)，不时进行搅拌20min，再边搅拌边加入120μg去氧胆酸，置37℃并不时进行搅拌，至裂解液变粘稠时，加入0.61μl DNA酶I(1mg/ml)，置于室温直到裂解液不粘稠时，4℃ 12 000g离心15min，去上清，沉淀重悬于9倍体积含0.5% TritionX-100和10mmol/LEDTA(pH8.0)的裂解液中，室温放置5min，再4℃ 12 000g离心15min，吸出上清备用。再将沉淀重悬于20μl水中，-20℃保存备用。取上清和沉淀悬液各7.5μl加入7.5μl 2×SDS加样缓冲液，100℃煮沸5min，取15μl SDS-PAGE电泳检测表达产物。

　　2  结果

　　2．1  目的基因的克隆和鉴定  将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在1 300bp左右位置处可见一条清晰的特异性条带，与预期片段大小（1 350bp）相符，将重组质粒pETJKM/TpN47经BamHⅠ酶和Hind Ⅲ双酶切后得到2个片段，其大小分别约为5.4kb和1.35kb与预期一致（图1）。序列测定结果与基因库报到的序列完全一致。

　　2．2  重组质粒TpN47-pETJKM在宿主菌E. coli DH5α中，经IPTG诱导表达出一分子量为47KD的蛋白质，见图2。

　　图1  目的基因克隆、重组及酶切的凝胶电泳图（略）

　　1: λDNA/HindIII Marker；2: 重组质粒；3: 重组质粒双酶切； 4: PCR产物大小约1350bp； 5: 阴性对照。
　　
　　图2  表达重组蛋白SDS-PAGE分析结果（略）

　　1：BL21(plys)宿主菌对物；2：TpN47/BL21(plys)诱导后表达；3：TpN47/BL21(plys)未诱导对照; 4：标准参照物。

　　3  讨论
   
　　TP外膜抗原有22种，主要是TpN47、TpN44.5(a)、TpN36、TpN35、TpN29-35、TpN17、TpN15和TpN24-28等［3,4］。TpN47是TP外膜蛋白中含量最高的成份之一, Radolf等［5］分别用Triton X-100和Triton X-114处理TP菌体，提取外膜成分，经SDS-PAGE和免疫印迹技术分析，发现其中富含47KD蛋白成分，并利用单克隆抗体进行定位，发现其存在于TP外膜。这种Triton可溶性蛋白在家兔早期感染时可诱发抗体产生，在恢复期血中为主要抗体。大量的研究表明，TP表面为典型的脂质双层结构的外膜，与其它革兰氏阴性菌相比，TP外膜可能磷脂含量较高，而蛋白质成分含量较少，因而对去污剂相当敏感，以TP 1×109～1×1010/ml悬于TritonX-100(0.1%～0.2%)中,37℃ 30min,以47KD为主要成分的外膜蛋白可释放出来，但某些革兰氏阴性菌外膜对此处理完全抵抗，除非完整的结构被破坏，如去除二价阳离子。但在过量的Mg2+情况下，TP外膜对去污剂也敏感，表明其分子结构与其它革兰氏阴性菌脂多糖不同。现研究表明47KD蛋白为脂蛋白，尽管早期人们认为其为两性蛋白（亲水性和疏水性），但现在证明为疏水性蛋白质，因其与脂类以共价键结合（酰化作用）。Norgard等［6］已将TP47KD蛋白的基因克隆后转入大肠杆菌中表达，表达产物和天然TP47KD蛋白质氨基酸序列一致，均由367个氨基酸残基组成。
   
　　本研究成功克隆表达了梅毒螺旋体TPN47抗原，以探讨其在TP免疫诊断以及预防性疫苗方面的作用。亦有研究表明TP47KD具有高度免疫原性，家兔在接种TP47后7～10d后即可产生抗TP47KD抗体，开始以IgM为主，以后逐渐产生IgG，但与极细密螺旋体(T. perteuce)和地方性密螺旋体(T. endemicum)亚种抗原成分有交叉。SDS-PAGE分析表明TpN47编码蛋白质分子量约为47KD。下一步工作，我们将把该重组抗原结合先前克隆表达的Tpp17用于检测大量临床血清标本［7］，并结合临床资料以证实其生物活性，并与目前使用的TP检测方法进行对比，探讨在检测各期TP中的特异性和敏感性。

【参考文献】
  1］ 熊礼宽. 性传播感染疾病实验诊断研究的重要性［J］. 中华检验医学杂志,2004，27(12)：875～877.

　　［2］ 萨姆布鲁克 J，费里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T. 著. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫. 译. 第2版. 北京：科学出版社，1999, 888～897.

　　［3］ Castro R, Prieto ES, Santo I, et al. Evaluation of an enzyme immunoassay technique for detection of antibodies against Treponema Pallidum［J］. J Clin Microbiol, 2003, 41: 250～253.

　　［4］ 熊礼宽, 周华. 梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展［J］. 国外医学流行病学传染病学分册, 1999, 26:270～273.

　　［5］ Radolf JD, Chamberlain NR, Clausell A, et al. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent triton X-114［J］. Infect Immun, 1988,56(7):490～498

　　［6］ Norgard MV, Arndt LL, Akins DR, et al. Activation of human monocytic cells by Treponema pallidum and Borrelia burgdorferi lipoproteins and synthetic lipopeptides proceeds via a pathway distinct from that of lipopolysaccharide but involves the transcriptional activator NF-kappa B［J］. Infect Immun, 1996, 64(9):3845～3852.

　　［7］ 熊礼宽，周华，宁波，等. 梅毒螺旋体Tpp17基因的扩增、克隆及表达［J］.中华微生物学和免疫学杂志, 2000, 20(6):499～500.

作者单位：深圳市福永医院，广东 深圳 518103; 深圳市慢性病防治院性病防治中心，广东 深圳 518020; 深圳大学生命科学院，广东 深圳 518060.