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首页医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2008年第8卷第5期

氯化血红素对大鼠肝脏血红素加氧酶1的诱导表达

来源:中国热带医学
摘要:【摘要】目的观察氯化血红素(hemin)对大鼠肝脏血红素加氧酶-1(HO-1)的诱导表达作用。方法SD大鼠18只随机分为两组:氯化血红素处理组共10只,每日早晨hemin15mg/kg腹腔注射,每24h重复1次。第10d处死大鼠后检测血清ALT、AST水平,用免疫组织化学方法观察肝组织HO-1的表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-P......

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【摘要】  目的 观察氯化血红素(hemin)对大鼠肝脏血红素加氧酶-1(HO-1)的诱导表达作用。 方法 SD大鼠18只随机分为两组:氯化血红素处理组共10只,每日早晨hemin 15mg/kg腹腔注射,每24h重复1次;生理盐水对照组共8只,每日早晨同时间腹腔注射等量生理盐水,每24h重复1次。第10d处死大鼠后检测血清ALT、AST水平,用免疫组织化学方法观察肝组织HO-1的表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织HO-1mRNA表达。 结果 hemin处理组与生理盐水对照组大鼠血清ALT,AST水平无明显差异。hemin处理组肝组织HO-1表达明显高于生理盐水对照组。 结论 hemin能诱导大鼠肝组织HO-1表达明显增加。

【关键词】  氯化血红素;血红素加氧酶;肝病

肝脏疾病是全球性的重要卫生问题,是危害国人健康和医疗费用支出的重要原因,找到一种有效的防治肝脏疾病方法对促进国人健康、减少医疗开支、促进社会经济发展具有重要意义。抗氧化损伤、脂质过氧化损伤在肝脏疾病中起重要作用。人体内发现血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO)已有几十年的历史,近来研究显示HO-1对氧化应激所至的细胞损伤有保护作用[1]。本研究采用氯化血红素(Hemin)诱导的方法,观察了氯化血红素对大鼠肝脏HO-1表达的影响,为肝脏疾病的治疗寻找可能的途径。

  1  材料和方法

  1.1  材料

  1.1.1  实验动物  SD成年雄性大鼠28只,体重143~236g,由温州医学院动物实验中心提供。

  1.1.2  实验用药及试剂  氯化血红素,由温州医学院器官移植研究所陈必成博士提供; HO-1兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;正常羊血清、生物素化羊抗兔二抗及链酶亲和素-过氧化物酶复合物购自北京中山公司;RT-PCR引物购自上海生工生物工程有限公司。

  1.1.3  动物分组及处理  动物随机分2组,即氯化血红素处理组、生理盐水对照组。氯化血红素处理组共10只,每日早晨hemin 15mg/kg腹腔注射,每24h重复1次,共10d;生理盐水对照组8只,每日早晨同时间腹腔注射等量生理盐水,每24h重复1次。于实验第11d处死动物,颈动脉采血,低温离心取血清,取新鲜肝组织冰冻切片。

  1.2  方法

  1.2.1  ALT和AST测定  采用速率法以全自动生化分析仪测定大鼠血清ALT和AST水平。

  1.2.2  肝脏组织HO-1检测  按SP免疫组化试剂盒中的说明书操作,DAB显色。镜下观察免疫反应阳性细胞为细胞质染成棕黄色或有深棕色颗粒沉积。用HMIAS-2000型成像分析仪进行定量测定,每个切片随机取5个高倍视野,测定每个视野面积的光密度OD值,取平均值为其OD值。

  1.2.3  逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肝脏HO-1mRNA表达  采用Trizo l 一步法提取总RNA,测定其浓度以及260nm和280nm处吸光度比值(A 260/A280)。将2μg mRNA 逆转录为cDNA。引物序列为:HO-1(224bp):上游为5’-AAACAAGCAGAACCCAGTC-3’,下游为5’-AGAGGTCACCCAGGTAGCG-3’。反应条件:94℃、45s,57℃、45s,72℃、60s,扩增30个循环,最后72℃延伸10min。取8ul扩增产物,在质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶电泳,时间30~40min,电压100V,采用Kodak Digital Science成像分析系统扫描电泳条带。PCR产物半定量用Tiger 920G图象分析系统扫描电泳图的HO-1和相应的β-actin,测标本电泳条带的面积及平均灰度值,两者的乘积为积分灰度值,将HO-1条带的积分灰度值与β-actin条带的积分灰度的比值作为HO-1 mRNA的相对表达强度。

  1.3  统计学处理  所有数据以均数±标准差(x±SDM)表示,组间比较采用t检验,P<0.05表明有统计学意义,P>0.05表明无统计学意义。

  2  结果

  2.1  血清ALT、AST水平变化  如表1中所示,hemin处理组与生理盐水对照组大鼠血清ALT,AST水平无明显差异(P>0.05)。

  表1  各组大鼠血清ALT、AST水平的比较(略)

  注:两组比较P>0.05。

  2.2  免疫组织化学检查  肝脏组织切片免疫组化显示,经氯化血红素处理组大鼠肝脏HO-1明显表达,而生理盐水对照组几乎不表达。两组切片免疫组化光密度值测定结果分别为0.283±0.032和0.025±0.012。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

  2.3  HO-1mRNA表达  生理盐水处理组及生理盐水对照组大鼠肝组织HO-1mRNA没有表达;氯化血红素处理可明显增强急性乙醇肝损伤的HO-1mRNA表达。各组HO-1mRNA相对表达均值为:生理盐水对照组0.114±0.032,氯化血红素处理组0.541±0.085,两组比较P<0.05,见图1。

  图1  大鼠肝组织的HO-1mRNA表达(略)

  Figure 1  The expression of HO-1 mRNA in liver of rats

  1.Marker   2. 氯化血红素处理组   3. 生理盐水对照组

  3  讨论
   
  1968年Tenhunne首次在人体内发现血红素加氧酶(HO),至今已有几十年的历史,以往认为HO的作用是催化血红素(Heme)在机体内氧化降解,维持血红素代谢平衡,近年来认为其在氧化应激中具有重要作用[1]。血红素加氧酶是一种催化血红素降解的酶,在NADPH、NADPH-细胞色素P-450还原酶和分子氧存在下,使铁卟啉IXa氧化产生胆绿素IXa。胆绿素IXa在胆绿素还原酶(biliverdin reductase,BVR)催化下,很快生成胆红素IXa。HO催化血红素降解时,生成两个重要产物,胆绿素和CO。前者还原成胆红素后有强抗氧化能力,后者是一种神经递质。迄今为止,共发现三种HO的同工酶,它们分别是三种不同的基因编码产物,在分子量、氨基酸组成方面均存在较大差异[2]。HO-2是组成型血红素加氧酶;HO-3分布广泛,从分子结构上与HO-2相似,而其催化活性很弱。HO-1为诱导型HO,亦称热休克蛋白32(HSP32),许多诱导因素均可引起其活性及蛋白量增加[2~5]。机体内HO的分布不均衡,生理情况下HO活性最高的器官为脾、睾丸及脑。正常情况下机体肝脏仅发现HO-2,HO-1表达阴性,予诱导剂后肝细胞可大量表达HO-1,主要见于细胞浆和核膜,散在分布[3,6],而HO-2活性无明显变化。HO-1是胆红素形成过程中的第一种酶,也是一种限速酶,所产生的胆绿素及胆红素具有较维生素E更强的抗氧化作用,在体内对氧化损伤有明显的保护作用,对抗氧化应激而保护细胞[5,7]。而HO-1活性的增高可促进运铁蛋白的合成,通过增加细胞内铁的流出而具有细胞保护作用[8]。HO-1作为抗氧化应激因子,其对细胞氧化损伤的保护作用正引起人们的重视。刘烈刚等研究认为,HO-1的表达升高可能对乙醇所致的肝细胞氧化损伤有保护作用[9],另近年来许多动物实验证明,诱导HO-1表达有助于机体的抗氧化应激和对缺血再灌注损伤的保护。HO产生的一氧化碳CO近年来也受到了人们的重视,发现HO-1源的CO在氧化应激下能选择性抑制炎性细胞因子的表达,增加抗炎细胞因子IL-10的表达,保护肝细胞的微循环[8]。HO系统对NOS有着重要的调控作用,也是HO系统抗氧化作用的一种表现。mmol量的NO在体内具有明显的氧化毒性,HO-1能抑制NOS在体内的合成、加速NOS的更新速率、抑制NOS的活性[10]。
   
  本实验中,采用氯化血红素(Hemin)大鼠腹腔注射方法,观察其对大鼠肝脏HO-1的诱导表达作用。hemin又名血晶素,是HO-1的底物,同时又是HO-1的促进剂,能诱导HO-1基因表达[11]。肝脏组织切片免疫组化显示,经氯化血红素处理组大鼠肝脏HO-1明显表达,生理盐水对照组几乎不表达。肝组织常规HE染色显示处理组及生理盐水对照组无明显差别。两组大鼠血清ALT、AST无统计学差别(P>0.05)。RT-PCR检测结果显示hemin处理组肝组织HO-1mRNA表达明显高于生理盐水对照组。实验结果表明氯化血红素能诱导大鼠肝脏血红素加氧酶1的显著表达。
   
  HO-1不但在氧化应激中发挥重要作用,而且其代谢产物CO、胆绿素及胆红素、Fe都具有重要的生理功能,因而采用药物调节HO-1活性或HO-1的表达,应是很有前途的抗自由基损伤治疗方式。鉴于抗氧化损伤、脂质过氧化损伤为肝细胞损伤的主要机制, HO-1对肝脏疾病的治疗方面应有着广阔的前景。

【参考文献】
  [1] Maines MD.The heme oxygenase system:a regulator of second messenger gases[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1997,37:517~554.

  [2] Mccoubrey Wk Jr,Huang TJ,Maines MD.Isolation and characterization of a cDNA from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygenase-3[J].EUR J Biochem,1997,247:725~732.

  [3] Thiele GM,Worrall S,Tuma DJ, et al.The chemistry and biological effects of malondialdehyde- acetaldehyde adducts[J].Alcohol Clin Exp Res,2001,25:218S~224S.

  [4] Stephen F,Stewart,Matteo Vidali,et al.Oxidative Stress as a Trigger for Cellular ImmuneResponses in Patients With Alcoholic Liver Disease Hepatology,2004,Volume 39,Issue1:197~203.

  [5] Otterbein LE,Choi AM.Heme oxygenase:colors of defense against cellular stress[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000,279(6):L1029~1037.

  [6] Xu D,Thiele GM,Kearley ML,et al.Epitope characterization of malondialdehyde-acetaldehyde adducts using an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Chem Res Toxicol,1997,10:978~986.

  [7] Stocker R,Yamamoto Y,Mcdonagh AF,et al.Bilirubinisan antioxidant of possible physiological importance[J].Science,1987,253:1043~1046.

  [8] Shu Z,Jung M,Beger HG,et al.pH-dependent changes of nitric oxide,peroxynitrite,and reactive oxygen species in hepatocellular damage[J].Am J Physiol,1997,273:G1118~1126.

  [9] 刘烈刚,姚平,章锡平,等.急性酒精暴露对人原代肝细胞HO-1mRNA表达的影响[J].营养学报,2003,25(3):294~297.

  [10] 徐建平. 血红素加氧酶系统与氧化应激[J].国外医学·生理、病理科学与临床分册,2002,8,22(4):371~373.

  [11] Levere RD.Effect of heme arginate administ ration on blood pressure in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Clinical Investigation,1990,86:213~219.


作者单位:温州医学院附属第一医院消化内科,浙江 温州 325000.

作者: 黄庆科,金抒清,王剑虹 2010-1-13
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