SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

【摘要】  目的 构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体(EGFP)的融合表达质粒pEGFP-N2-SET并获得表达。 方法 根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、Hind Ⅲ和Kpn I 酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP-N2载体中，获得重组质粒pEGFP-N2-SET。以LipofectamineTM 2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。 结果 经DNA测序鉴定证实，pEGFP-N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。 结论 SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。

【关键词】  癌蛋白SET；绿色荧光表达载体；蛋白磷酸酶2A

SET又称I2PP2A或TAF-1β，在急性未分化型白血病中首次鉴定［1］，在细胞中广泛存在。SET是蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A，PP2A）的胞内抑制蛋白，具有特异性、非竞争性和热稳定性［2］。PP2A是真核生物体内主要的丝-苏氨酸蛋白磷酸酶，在DNA复制与损伤修复、信号转导、细胞分化及细胞凋亡等生理过程中具有重要的调节作用。PP2A活性的改变与肿瘤发生有一定联系，许多细胞毒素的促肿瘤作用与抑制PP2A的活性有关［3］。在肝细胞癌变中观察到I2PP2A/SET基因表达上调，PP2A活性受抑制［4］。SET通过抑制PP2A的活性而使细胞色素P450c17去磷酸化以及调节其17，20裂解酶活性来改变性甾体的形成［5］。
   
　　在前期研究中，我们利用差异蛋白组学技术发现PP2A抑制剂SET在三氯乙烯（Trichloroethylene，TCE）刺激L-02肝细胞后高表达［6］，尚不清楚SET在TCE致肝细胞毒性中的作用机理，也未见相关报道。本研究旨在构建以EGFP为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N2-SET，为进一步研究SET基因的结构和功能奠定了基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要材料和试剂  质粒pEGFP-N2购自美国Clontech公司，大肠埃希菌DH5α为本室保存。限制性内切酶和PCR片段回收及纯化试剂盒为MBI公司产品，T4 DNA连接酶、PrimeSTARHS(Premix)、标准DNA分子量Marker购自大连宝生物公司，UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司，High Pure RNA Isolation Kit购自ROCHE公司，EndoFree Plasmid Maxi kits购自QIAGEN公司，LipofectamineTM 2000和0pti-MEN 培养液为Invitrogen公司产品，胎牛血清购于Gibico公司。人L-02肝细胞系为本实验室保存。引物的合成及DNA序列测定均由大连宝生物公司完成。

　　1.2  方法

　　1.2.1  SET目的基因的PCR扩增  将在液氮中冻存的L-02肝细胞复苏，用含15％胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基培养，取1×106/mL的L-02肝细胞，按说明书操作提取细胞总RNA，经紫外分光光度计检测其纯度及含量。20μl逆转录反应体系：4μl  5×AMV buffer，2μl dNTP Mixture(10mmol/L)，1μl随机引物(10μmol/L)，0.5μl RNase Inhibitor (40U/μl)，2μl AMV(5 U/μl)，500～1 000ng总RNA，其余用Rnase Free ddH2O补充。反应程序：42℃ 60min；94℃ 3 min。-20℃保存备用。
   
　　根据人SET cDNA的全长序列设计一对针对SET开放阅读框（Open reading frame,ORF）的引物，在上游引物5’端引入Hind Ⅲ酶切位点和KOZAK序列（CGCCAC C），下游引物去除终止密码子并引入Kpn I酶切位点。上游引物：5’- CCC AAG CTT CGC CAC CAT GGC CCC TAA ACG CCA GTC -3’；下游引物：5’- ATA GGT ACC CCG TCA TCT TCT CCT TCA TCC -3’。以肝细胞cDNA为模版，采用PrimeSTARHS(Premix)试剂盒进行PCR，反应条件：95℃预变性1min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。将PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳分析。按胶回收试剂盒说明书操作回收872bp的目的cDNA扩增片段，经Hind Ⅲ和Kpn I双酶切后，回收备用。

　　1.2.2  重组真核表达质粒pEGFP-N2-SET的构建及鉴定  酶切后回收纯化的目的基因cDNA扩增片段和质粒载体pEGFP-N2（Hind Ⅲ和Kpn I双酶切回收纯化产物）在T4 DNA 连接酶作用下16℃连接过夜；将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取克隆，扩大培养，送大连保生物公司测序鉴定。

　　1.2.3  重组真核表达质粒pEGFP-N2-SET转染L-02肝细胞及其表达  实验设pEGFP-N2-SET转染组和空白对照组。转染前1d，细胞按1×106/ml的浓度接种于6孔板，每孔2ml，并换成无抗生素的培养基。第二天细胞融合度达90％～95％时，分别用250μl的Opti-MEM稀释4μg的质粒和10μl的LipofectamineTM 2000脂质体，两者混合后放置15min，均匀滴加入培养孔中，置37℃、5％CO2培养箱中培养，6h后换成15％胎牛血清的RPM I-1640培养基继续培养。转染24h后，PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察重组蛋白的表达。

　　2  结果

　　2.1  SET目的基因的PCR扩增  SET目的基因PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统上观察电泳结果，可见约在900bp有一条特异性条带，与预计长度(872bp)一致（图1）。

　　2.2  重组真核表达质粒的构建及鉴定  将去除终止密码子的SET基因片段克隆入荧光表达载体，构建了质粒pEGFP-N2-SET，如图2所示。测序结果表明，插入片段与设计相符(图3)，用QIAGEN公司的去内毒素的大提试剂盒制备转染质粒pEGFP-N2-SET和pEGFP-N2，紫外分光光度计检测其A260／A280均为1.8～1.9，可用于转染。

　　图1  SET目的基因PCR扩增结果（略）

　　M:DNA Marker; 1:SET基因片段

　　图2  pEGFP-N2-SET重组表达载体的构建（略）

　　图3  pEGFP-N2-SET重组表达载体的DNA测序结果（部分）（略）

　　2.3  荧光显微镜观察  倒置荧光显微镜下观察，转染48h后，重组质粒pEGFP-N2-SET转染组有大量细胞发射绿色荧光，空白对照组无绿色荧光。

　　图4  倒置荧光显微镜下观察转染48h后重组蛋白的表达（100×）（略）

　　3  讨论
   
　　近年来的研究表明，PP2A被认为可能是一个潜在的肿瘤抑制因子，在人类的结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和皮肤癌等多种恶性肿瘤中都发现有PP2A的基因突变或活性改变。研究发现PP2A的活性可促进细胞凋亡，PP2A活性丧失，细胞凋亡受阻。在由死亡受体FasL，TNFR等诱导的细胞凋亡中，加入PP2A的强抑制剂CalyculinA和I2PP2A（SET），细胞凋亡被明显抑制。这两种由外源或内源的PP2A抑制剂引起的细胞凋亡抑制机制十分相似，都是由于PP2A的活性降低而使细胞内MAPK/ERK活性升高所致［7］。许多研究证实，SET是DNA复制、染色质重塑及基因转录中的一个重要调节因子。在体外，SET能激活腺病毒DNA的复制［8］；SET也可以通过改变组蛋白-DNA的相互作用来激活转录［9］。SET与组蛋白的相互作用是通过一个被称为乙酰转移酶抑制剂pp32的复合物来完成的，而pp32是一个肿瘤抑制蛋白，同样具有PP2A的抑制活性［2,10］。SET可能通过抑制细胞周期蛋白B-cdk1及PP2A活性对细胞周期进程起调节作用［11］。
   
　　报告基因GFP最早是从水母中分离出来的，其基因编码区序列长714bp，蛋白相对分子量约26kDa。GFP在450～490nm的蓝光激发下发出绿色荧光，通过显微镜可直接观测，快速、简便。GFP无种系依赖性，对宿主细胞无毒性作用，而且尚未发现其相连目的基因的功能产生影响［12］。目的基因（蛋白）与GFP融合表达，通过荧光显微镜观察目的蛋白在细胞内的空间分布、转运及相互作用等分析。GFP作为一种新型的基因报告分子，已广泛应用于蛋白质分子的表达与定位等研究。真核表达质粒pEGFP-N2的EGFP是GFP的一种突变体，其基因编码区含有190多个沉默碱基突变，具有更适合在人类细胞中表达的开放阅读框，且mRNA翻译效率提高，使得GFP表达增强，所产生的荧光比野生型GFP增强约35倍，因而更适合于检测各种细胞中GFP融合蛋白的表达情况。本实验利用含CMV强启动子的pEGFP-N2，将ATG前带有Kozak序列及去除终止密码子的SET cDNA，克隆至pEGFP-N2，成功构建了SET融合表达载体，为今后研究SET在TCE致肝细胞毒性中的作用机理奠定了的实验基础。

【参考文献】
  ［1］ Von Lindern M,van Baal S,Wiegant J,raap A,Hagemeijer A,Grosveld G(1992).Mol Cell Biol 12:3346～3355.

　　［2］ Li M, Makkinje A, Damuni Z. (1996b). J Biol Chem 271:11059～11062.

　　［3］ Sekijima M，Tsutsuni T，Yoshida T，et al. Enhancement of glutathione S-transferase placental-form positive liver cell foci development by microcystio-LR in aflroxin B1-imitiated rats［J］. Carcinogenesis,1999,20(1):161～165.

　　［4］ Fukukawa C，Shima H，Tanuma N，et al. Up-regulation of I2PP2A/SET gene expression in rat primary hepatomas and regenerating livers［J］. Cancer lett, 2000, 161:89～95.

　　［5］ Pandey AV, Mellon SH, Miller WL. (2003). J Biol Chem 278:2837～2844.

　　［6］ 黄海燕，刘建军，庄志雄，等.三氯乙烯诱发L-02肝细胞毒的双向电泳分析及质谱鉴定［J］.中华预防医学杂志，2005，39 （3）：175～178.

　　［7］ Ann-S H, Rma LB , Andrey M, et al. Type-2A protein phosphatase activity is required to maintain death receptor responsiveness［J］.Oncogene, 2003, 22(48):7677～7686.

　　［8］ Matsumoto K, Nagata K, Ui M, Hanaoka F. (1993). J Biol Chem 268:10582～10587.

　　［9］ Okuwaki M, Nagata K. (1998). J Biol Chem 273:34511～34518.

　　［10］ Kutney SN, Hong R, Macfarlan T, Chakravarti D. (2004).J Biol Chem 279: 30850～30855.

　　［11］ Canela N, Rodriguez-Vilarrupla A, Estanyol JM,Diaz C, Pujol MJ, Agell N et al. (2003). J Biol Chem 278:1158～1164.

作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020.