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【摘要】 目的 探讨微囊藻毒素-LR对HL60细胞的遗传毒性效应。 方法 不同剂量的MCLR作用HL60细胞24h或48h后，应用彗星实验及微核实验分别检测DNA链断裂和染色体损伤情况。 结果 10～100μg/ml剂量的MCLR引起HL60细胞明显的DNA链断裂，染毒量与DNA链断裂之间呈现剂量-反应关系。相同剂量的MCLR还引起HL60细胞微核率升高，随着染毒剂量的增加，微核率呈增高趋势。 结论 MCLR可引起HL60细胞DNA和染色体损伤，具有细胞遗传毒性。
【关键词】 微囊藻毒素-LR；彗星实验；微核实验；HL60细胞
微囊藻毒素（Microcystins,MCLR）是由生长于富营养化湖泊、池塘或江河的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、水华束丝藻等蓝藻产生的一组具有肝脏毒性的单环多肽毒素，其中以微囊藻毒素-LR（MCLR）毒作用较明显为其主要代表物［1］。目前，国内外对MCLR的遗传毒性研究尚无一致结论，对于MCLR能否直接诱导细胞DNA损伤存在不同观点［2,3］。本研究采用不同剂量的MCLR处理人早幼粒白血病细胞系HL60，用彗星实验与微核实验检测其遗传毒性，以观察MCLR对人类细胞DNA及染色体损伤的遗传毒性效应。
1 材料与方法
1.1 细胞和主要试剂 HL60细胞由日本癌研究资源库馈赠。MCLR购自瑞士ALEXIS公司（Lausen, Switzerland），纯度>98%，临用时用0.1%二甲基亚砜（DMSO）溶解。DMSO和丝裂霉素C购于日本和光纯化学工业公司，RPMI 1640培养液为日本Nikken公司产品,其它试剂均购自Sigma公司。
1.2 细胞培养和染毒 HL60细胞在含10%加热失活小牛血清及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素（Gibco-BRL,USA）的RPMI1640培养液中，置37℃，5% CO2和95% O2条件下培养。收集对数生长期细胞，调节细胞数为5×104/ml，培养24h后，加入MCLR，使毒素的浓度为1、3、10、30、100μg/ml，并以0.1%DMSO作阴性对照，每个剂量组设2个平行样，继续培养24h或48h后收集细胞分别进行彗星实验和微核实验。100μM H2O2作彗星实验的阳性对照，0.15%丝裂霉素C作微核实验的阳性对照。用台盼蓝拒染法检测细胞的存活率。
1.3 慧星实验 主要参照Singh［4］的方法并稍作改进。用0.5%普通凝胶预处理玻片及制备第1层凝胶．用0.75%低融点凝胶在37℃与细胞悬液混合制备第2层凝胶，再用0.75%低融点凝胶制备第3层凝胶。然后经细胞溶解、DNA解旋及电泳、中和与染色。在荧光显微镜(Olympus BX50)下，用图像装置(FCC 600 Flavel Color Camera)及彗星尾测量分析软件(DHS-SCG，Ver1.0，1998，KEIO Electronic，Japan)测量分析100个细胞核的尾矩值 (tail moment，彗星尾长×DNA在尾部的百分比)。
1.4 微核实验 参照Matsuoka［5］的方法，细胞置0.075M KCl溶液中孵育10min，Carnoy’s液（甲醇:乙酸=3:1）固定30min，然后用Carnoy’s液洗2次，重悬在含1%乙酸的甲醇中，取一滴细胞悬液涂片干燥后，40μg/ml吖啶橙染色后，在荧光显微镜下观察1 000个完整的间期细胞，计算微核率。
1.5 统计分析 所有实验重复做3次取均值，采用SPSS11.0统计软件处理数据。彗星实验和微核实验分别采用非参数Mann-Whitney U-test和卡方检验进行统计分析。
2 结果
2.1 HL60细胞对MCLR的细胞毒性反应 HL60细胞经MCLR染毒24h后，用台盼蓝拒染法分析，0、1、3、10、30和100μg/ml剂量组的细胞存活率分别为(93.7±7.21)%、(98.06±6.64)%、(99.22±4.65)%、(98.35±2.64)%和(93.57±5.44)%和(78.67±5.25)%。与阴性对照比较，仅100μg/ml剂量组细胞的存活率明显降低(卡方检验，P<0.05),其余各组剂量未出现细胞毒性。
2.2 MCLR对HL60细胞DNA损伤的作用 HL60经MCLR染毒24h后，在荧光显微镜下观察,发现阴性对照组的细胞核呈圆形，无彗星尾出现，MCLR染毒组的细胞核则出现不同程度的拖尾现象（图1）。用图像分析软件进行定量分析时发现，低剂量（≤3μg/ml）染毒组细胞的尾矩值与对照组比较无显著性差异。但高剂量（≥10μg/ml）染毒组细胞的尾矩值显著增加(P<0.01)，表明MCLR处理的细胞出现不同程度的DNA链断裂(图1)。染毒量与DNA链断裂之间呈现明显的剂量-反应关系（图2）。
图1 MCLR致HL60细胞DNA损伤的形态学观察（略）
Fig 1 Comet image of HL60 cells treated with or without MCLR
图2 不同剂量MCLR处理HL60细胞的DNA损伤效应（略）
Fig 2 MCLR-induced DNA strand breaks expressed as tail moment in HL60 cells
注：**与阴性对照组比较，P<0.01。
2.3 MCLR对HL60细胞微核形成的影响 HL60细胞经MCLR染毒48h后，高剂量染毒组（≥10μg/ml）不同程度地出现含有一个或数个微核的微核细胞。与阴性对照组比较，10、30和100μg/ml剂量组的微核率明显升高(P<0.05), 随着MCLR染毒剂量增加，微核率呈增高趋势。
表1 MCLR诱发HL60细胞微核的实验结果（略）
Table 1 Induction of micronuclei by MCLR in HL60 cells
注：*与阴性对照组比较，P<0.05。
3 讨论
目前，微囊藻毒素污染与人类健康的关系问题已引起全球的广泛关注，而MCLR是微囊藻毒素中毒性最强的一种。流行病学调查发现原发性肝癌高发与饮水中微囊藻毒素污染有关［6］。迄今为止，MCLR的遗传毒性研究尚无一致结论［2,3］。有研究报道，无论是微囊藻毒素提取物还是纯毒素(MCLR)Ames试验均为阴性［2］。Zhan等［3］用转基因小鼠遗传毒性试验证实MCLR在动物体内没有致突变性，是一种非遗传毒性促癌物。但Ding等［7］在彗星实验中观察到MCLR对原代培养大鼠肝细胞产生DNA损伤作用。研究结果不一致的原因可能与不同来源的微囊藻毒素提取物含有不同的毒素亚型以及种属间、组织间差异等有关。
本研究结果显示，10～100μg/ml的MCLR处理HL60细胞24h后，引起明显的DNA链断裂，染毒量与DNA链断裂之间呈现剂量-反应关系。非毒性剂量（10和30μg/ml）的MCLR亦诱发DNA链断裂，提示观察到的DNA链断裂可能不是继发于细胞毒性。微核试验的遗传学终点是观察染色体或有丝分裂器的损伤, 它的测定方法比较简单、可靠, 并且与染色体畸变率有很好的一致性。本研究发现相同剂量的MCLR处理HL60细胞48h后，微核率明显升高，随着染毒剂量的增加，微核率呈增高趋势，提示MCLR引起HL60细胞染色体损伤。
MCLR引起DNA损伤及微核形成的机理尚不十分明确，MCLR引起的DNA损伤可能与活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)有关。MCLR通过刺激细胞产生或蓄积大量的活性氧，如过氧化氢（H2O2 ）和超氧阴离子自由基（O2-），最终对细胞DNA产生氧化损伤作用［2］。但是，MCLR如何刺激细胞产生ROS及诱发微核形成仍然有待进一步研究。
【参考文献】
［1］ Nishiwaki MR,Ohta T, Nishiwaki S, et al. Liver tumor promotion by the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin-LR［J］.J Cancer Res Clin Oncol, 1992,118(6):420～424.
［2］ Gehringer MM. Microcystin-LR and okadaic acid-induced cellular effects: a dualistic response［J］. FEBS Lett，2004，557(3):1～8.
［3］ 詹立,张立实,王莉,等.微囊藻毒素联合DEN诱发转基因小鼠体内遗传毒性实验研究［J］.现代预防医学，2005，32(5):415～416.
［4］ Singh NP, McCoy MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells［J］. Exp Cell Res, 1988,175(1):184～191.
［5］ Matsuoka A, Yamazaki N, Suzuki T, et al. Evaluation of the micronucleus test using a Chinese hamster cell line as an alternative to the conventional in vitro chromosomal aberration test［J］. Mutat Res, 1992, 272(3):223～236.
［6］ 林莉萍,黄强胡,大林,等.水源水及自来水中微囊藻毒素污染的流行病学研究［J］.中国热带医学,2007，7(1):35～36.
［7］ Ding WX, Shen HM, Zhu HG, et al. Genotoxicity of microcystic cyanobacteria extract of a water source in China［J］. Mutat Res, 1999, 442(2):69～77.
［8］ Komatsu M, Furukawa T, Ikeda R, et al. Involvement of Mitogen-Activated Protein Kinase signaling pathways in microcystin-LR-induced apoptosis after its selective uptake mediated by OATP1B1 and OATP1B3［J］. Toxicol Sci, 2007, 97(2):407～416.
作者单位：广西医科大学公共卫生学院环境、职业与营养卫生学教研室，广西 南宁 530021； 广西医科大学医学科学实验中心,广西 南宁 530021； 大阪大学医学研究科社会环境医学研究室，日本 大阪 565-0871