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【摘要】 目的 构建带TAP标签流感病毒8质粒反向遗传包装系统，以期应用于流感病毒感染宿主细胞的蛋白分子机理的研究。 方法 两步RT-PCR方法扩增流感病毒8基因，人工合成TAP基因序列，并采用3次PCR的方法融合TAP基因和NP基因。将流感病毒8基因和NP-TAP基因克隆于反向遗传载体PIVVⅡ-1，阳性克隆用PCR和序列测定进行鉴定。 结果 经PCR和序列分析鉴定，筛选到了带TAP标签的流感病毒8质粒反向遗传阳性克隆。 结论 成功构建了带TAP标签的流感病毒8质粒反向遗传包装系统，为进一步研究流感病毒感染宿主细胞的蛋白分子机理奠定了基础。
【关键词】 流感病毒 反向遗传 蛋白相互作用
近年来，在分子病毒学研究领域兴起一门新型技术，即病毒的全长感染性cDNA克隆技术，是一种反向遗传操作技术。它解决了对RNA病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题。从cDNA克隆拯救出负链RNA全病毒是20世纪90年代分子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一，它开启了人们对病毒基因组进行人工操作和详细了解研究病毒基因及其产物功能的大门［1］。
流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个负链RNA片段组成。采用传统的分子生物学方法无法准确研究流感病毒每个基因的复制、转录及表达调控机制。随着反向遗传操作技术的日益发展和成熟，使得研究单个基因的功能以及基因产物对宿主细胞的分子影响成为可能。目前已经有多个反向遗传系统应用于流感病毒的分子表达机理、跨种属传播机制、疫苗研发等领域，但是利用反向遗传系统研究流感病毒基因产物对宿主细胞靶蛋白分子的影响，即解释流感病毒特别是人禽流感病毒感染细胞的蛋白分子机理，目前还未见报道。
本研究利用8质粒反向遗传包装系统，并体外人工添加TAP（Tandem affinity tag, TAP）标签，包装带TAP标签的重组流感病毒，旨在揭示流感病毒感染的蛋白分子机理。现就带TAP标签的流感病毒8质粒反向遗传包装系统的构建作一介绍。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒载体和酶 8质粒反向遗传包装质粒载体PIVVⅡ-1由国家流感中心提供；病毒毒株A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)由本实验室保存并经MDCK细胞培养；逆转录酶和高保真Taq酶购自Takara公司；限制性内切酶BsmB Ⅰ、BsA Ⅰ购自NEB公司；割胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒购自Qiagen公司；引物合成和TAP标签合成由上海捷瑞生物工程有限公司合成；基因序列测定由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
1.1.2 引物序列 根据载体PIVVⅡ-1上BsmB Ⅰ（BsA Ⅰ）酶切位点序列特征和流感病毒8个全长基因序列以及TAP序列，分别设计引物［2］，具体见表1。
表1 本实验中所用引物序列（略）
Table 1 Primer set used in this study
1.1.3 TAP序列 根据Guillaume Rigaut［3］等报道的TAP 氨基酸序列，选用人偏好的密码子重新设计TAP（552bp）序列如下：5’AGCATGGAGAAGCGGCGGTGGAAGAAGAACTTCATCG CCGTGAGCGCCGCCAACCGGTTCAAGAAGATCAGCAGCAGCGG CGCCCTGGACTACGACATCCCCACCACCGCCAGCGAGAACCTG TACTTCCAGGGCGAGCTGAAGACCGCCGCCCTGGCCCAGCACG ACGAGGCCGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGCAGCAGAACG CCTTCTACGAGATCCTGCACCTGCCCAACCTGAACGAGGAGCA GCGGAACGCCTTCATCCAGAGCCTGAAGGACGACCCCAGCCA GAGCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAACGACGC CCAGGCCCCCAAGGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGCAGCA GAACGCCTTCTACGAGATCCTGCACCTGCCCAACCTGAACGAG GAGCAGCGGAACGCCTTCATCCAGAGCCTGAAGGACGACCCC AGCCAGAGCGCCAACCTGCTGGCCGAGGCCAAGAAGCTGAAC GGCGCCCAGGCCCCCAAGGTGGACGCCAACAGCGCCGGCAAG AGCACC3’
1.2 方法
1.2.1 流感病毒8基因RT-PCR扩增 收集毒株A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1) MDCK细胞培养上清液，用Roche公司病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。用Universal引物进行cDNA合成，具体方法参见TAKARA公司MMV逆转录酶说明书。分别取5μl cDNA作模板，用TAKARA公司PrimeSTAR TAQ酶进行流感病毒8基因PCR扩增，反应条件为：95℃，5min；［94℃，10sec，42℃，15sec，72℃，3.5min］ 5cycles；［94℃，10sec，58℃，15sec，72℃，3.5min］ 35cycles，产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.2 流感病毒8基因与载体PIVVⅡ-1连接反应 分别将流感病毒8基因RT-PCR产物进行割胶回收，回收产物进行BsmB Ⅰ酶切反应（其中PB2和NA基因进行BsA Ⅰ酶切反应）。将载体PIVVⅡ-1进行BsmB Ⅰ酶切反应，酶切反应条件参见说明书。酶切反应完成后用PCR回收试剂盒回收酶切产物并进行DNA浓度定量（PB1基因在位、位有BsmB Ⅰ酶切识别位点，使用BsmB Ⅰ酶切后将PB1基因酶切成3个片段，分别回收3个片段。将等量的小片段(S)和中片段(M)进行T4连接酶4℃连接过夜，割胶回收连接产物(S+M)并将连接产物与等量的大片段(L)相同条件下连接，连接产物(S+M+L)割胶回收后用于与载体连接反应）。按照分子数1：3（载体：外源基因）比例进行T4连接酶连接，反应条件为4℃过夜。
1.2.3 流感病毒8基因连接产物转化大肠杆菌DH5α 分别将8基因连接产物按CaCl2法转化感受态大肠杆菌DH5α，在固体Amp-LB培养基平板37℃培养过夜。
1.2.4 流感病毒8基因阳性克隆PCR和序列分析鉴定 分别挑取流感病毒8基因转化平板单菌落，接种3ml Amp-LB培养基，37℃培养过夜。用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR阳性克隆质粒DNA进行序列分析。
1.2.5 带TAP标签的流感病毒NP基因反向遗传载体的构建 分别用NP-TAP正反向引物和TAP-NP正反向引物，以 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1) cDNA和人工合成TAP DNA为模板，用PrimeSTAR TAQ酶进行PCR扩增反应。反应条件分别为 95℃，5min；［94℃，10sec，42℃，15sec，72℃，3.5min］ 5cycles；［94℃，10sec，58℃，15sec，72℃，3.5min］ 35cycles和95℃，5min；［94℃，10sec，60℃，15sec，72℃，45sec］ 35cycles。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的条带DNA。将等量的NP-TAP和TAP-NP产物混合，加入PrimeSTAR TAQ酶进行延伸反应3.5min，然后加入NP-TAP正向引物和TAP-NP反向引物，进行PCR反应，反应条件为95℃，5min；［94℃，10sec，60℃，15sec，72℃，45sec］ 35cycles。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的条带DNA。BsmB Ⅰ酶切后与载体PIVVⅡ-1连接并转化到大肠杆菌DH5α。用PCR和DNA序列分析鉴定阳性克隆。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增流感病毒8基因 提取A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)病毒RNA后，采用2步法RT-PCR扩增流感病毒8基因片段。将RT-PCR产物进行1.5%凝胶电泳，结果如图1。由图1可以看出，根据所设计的引物和采用的RT-PCR反应条件，流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1) 8基因片段得到了比较理想的扩增。
2.2 流感病毒8基因阳性克隆PCR鉴定 流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)8基因（除PB1基因）全长片段RT-PCR片段BsmB Ⅰ(BsA Ⅰ)酶切反应后与相应酶切的载体PIVVⅡ-1进行连接反应。PB1基因经BsmB Ⅰ酶切后产生3个片段，分别为558bp(S)，709bp(M)和1075bp(L)。将小片段和中片段首先进行体外连接反应，再将连接产物(S+M)与大片段(L)进行连接反应，结果见图2。最后的连接产物(S+M+L)与BsmB Ⅰ酶切后的载体PIVVⅡ-1进行连接反应。将8基因连接产物分别称为PB2- PIVVⅡ-1，PB1- PIVVⅡ-1，PA- PIVVⅡ-1，HA- PIVVⅡ-1，NP- PIVVⅡ-1，NA- PIVVⅡ-1，M- PIVVⅡ-1和NS- PIVVⅡ-1。分别提取8基因转化克隆质粒DNA进行PCR鉴定，结果如图3。由图2可以看出，采用分段体外连接的方式，可以将PB1基因成功拼接为2300bp左右的片段。由图3可以看出，流感病毒8基因得到了成功扩增，所筛选的流感病毒8基因克隆PCR结果阳性。
图1 流感病毒8基因RT-PCR（略）
M: 1 000bp Ladder；1：PB2基因；2：PB1基因；3：PA基因；4：HA基因；5：NP基因；6：NA基因；7：M基因；8：NS基因；9：阴性对照。
Fig 1 Full-length amplification of all eight segments of influenza virus by RT-PCR
M: 1000bp Ladder; 1: PB2 gene; 2: PB1 gene; 3: PA gene; 4: HA gene; 5: NP gene; 6: NA gene; 7: M gene; 8: NS gene; 9: negative control.
图2 PB1基因分段拼接结果（略）
M: 1000bp DNA Ladder; 1: S 片段；2：M片段；3：L片段；4：S+M；5：S+M+L；6：PB1 PCR产物；7：阴性对照
Fig 2 Fragment to fragment splicing of PB1 gene
M: 1000bp DNA Ladder; 1: fragment S; 2: fragment M; 3: fragment L; 4: S+M; 5: S+M+L; 6: PCR of PB1; 7: negative control
2.3 带TAP标签的反向遗传载体的构建 为了下一步研究体外包装流感病毒单基因产物与宿主细胞的靶蛋白分子影响，将TAP（Tandem Affinity Purification）标签体外与流感病毒基因进行了拼接（本实验中将TAP与NP基因进行拼接）。通过设计嵌合引物，采用3次PCR的方式，将TAP基因添加到NP基因3’端，位于NP基因（敲除终止密码子）和3’端非编码序列之间。NP-TAP理论长度为1565+552bp。将NP-TAP与载体PIVVⅡ-1连接，构建NP-TAP- PIVVⅡ-1 反向遗传包装载体。转化后利用PCR对克隆质粒DNA进行鉴定，结果如图4。
图3 流感病毒8基因PCR鉴定（略）
M: 1000bp Ladder；1：PB2基因；2：PB1基因；3：PA基因；4：HA基因；5：NP基因；6：NA基因；7：M基因；8：NS基因；9：阴性对照。
Fig 3 PCR assay of 8 genes of influenza virus
M: 1000bp Ladder; 1: PB2 gene; 2: PB1 gene; 3: PA gene; 4: HA gene; 5: NP gene; 6: NA gene; 7: M gene; 8: NS gene; 9: negative control.
图4 NP-TAP- PIVVⅡ-1 反向遗传载体的鉴定（略）
M: 1000bp DNA Ladder； 1：NP RT-PCR产物； 2：TAP PCR产物；3：NP-TAP- PIVVⅡ-1 PCR产物；4：阴性对照
Fig 4 PCR assay for NP-TAP- PIVVⅡ-1 reverse genetics vector
M: 1000bp DNA Ladder; 1: RT-PCR of NP gene; 2：PCR of TAP；3：PCR of NP-TAP- PIVVⅡ-1; 4: negative control
2.4 流感病毒8质粒反向遗传系统序列分析 分别将PCR鉴定结果阳性的PB2- PIVVⅡ-1，PB1- PIVVⅡ-1，PA- PIVVⅡ-1，HA- PIVVⅡ-1，NP- PIVVⅡ-1，NA- PIVVⅡ-1，M- PIVVⅡ-1，NS- PIVVⅡ-1和NP-TAP- PIVVⅡ-1克隆质粒DNA进行序列测定（测序结果未列出）。序列分析表明流感病毒8基因和NP-TAP正确克隆于载体PIVVⅡ-1 BsmB Ⅰ(BsA Ⅰ)酶切位点，所测序列与Gene Bank中A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)8 各基因序列一致，说明已经成功了流感病毒8质粒反向遗传包装系统。
3 讨论
3.1 蛋白质组学研究的重点内容之一就是蛋白质-蛋白质间相互作用，特别是采用质谱分析技术手段时，要求快速且高重复性的蛋白质纯化技术。目前比较通用的方法是给目的蛋白质添加亲和纯化标签，并且要求添加的纯化标签不影响目的蛋白的结构和表达水平。近年来发展了亲和纯化（TAP）标签，包括FLAG标签、CBP标签、CBD标签、Protein A标签。研究发现虽然这些标签都不影响目的蛋白质功能，但只有CBP标签和Protein A标签能够做到融合蛋白的高回收率［3］。本实验中采用串联亲和纯化标签策略，即CBP-TEV-Protein A，利用两次亲和纯化策略，既能保证目的蛋白的高效回收，又能保证目的蛋白的纯度。
3.2 RNA病毒的反向遗传系统，是采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内有效地研究病毒基因组结构、功能和病毒-宿主相互作用。随着狂犬病毒的感染性cDNA 克隆的诞生和一个分节段的负链RNA病毒-布尼亚病毒的反向遗传学的成功，从克隆的cDNA产生流感病毒的技术难关终于在1999年得到突破。Neumann［4］研究小组构建了含A/WSN/33(H1N1)全部8个基因片段的克隆，构建了17质粒流感病毒反向遗传包装系统，此后Hoffmann［5］等又研究构建了流感病毒8质粒反向遗传包装系统，随后Neuman［6］等又相继研究构建了流感病毒1～6质粒反向遗传包装系统。
3.3 流感病毒反向遗传学可以用于流感病毒跨种属传播机制研究［7］，流感疫苗研发［8,9］、病毒毒力及其致病性研究以及流感病毒基因组结构与功能的研究等领域。总之，反向遗传学对阐明病毒的基因组结构与功能，从而对药物设计、理解流感病毒变异和跨种属传播的分子机制［10］、流感病毒感染的蛋白分子机理等领域产生重要的作用，将成为流感病毒分子生物学研究领域的一个重要的研究工具。
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作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020； 国家流感中心，北京 100050