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【摘要】 目的 验证HPLC-UV法测定环维黄杨星D对照品含量的可行性。 方法 以直接HPLC-UV法，同时选择苯甲酸苄酯作为内标，用NMR定量法对环维黄杨星D对照品进行含量测定，并对两种方法进行比较。 结果 二者测定的环维黄杨星D对照品的含量结果基本一致。 结论 HPLC-UV法测定环维黄杨星D对照品含量，与NMR定量法相比，显示方法更专属、准确、简单、经济。
【关键词】 环维黄杨星D HPLC-UV法 NMR定量法 对照品 含量测定
环维黄杨星D为自黄杨木中提取精制的有效生物碱，临床上已长期用于心脑血管疾病的治疗［1,2］,已被《中国药典》2005年版一部收载［3］。现行药典方法不能准确测定环维黄杨星D含量和有效控制其有关生物碱的限度。目前国内各生产厂家生产的环维黄杨星D原料药实际含量在55%～85%之间［4］，环维黄杨星D的结构见图1。
图1 环维黄杨星D结构 (C26H46N2O) （略）
作者已经研究报道的环维黄杨星D含量测定方法有HPLC柱前荧光衍生化法［5］、HPLC柱前紫外衍生化法和HPLC-MS法［6］等。采用HPLC柱前衍生化法，环维黄杨星D有关生物碱衍生化效率有所差异。而采用HPLC-MS法由于环维黄杨星D和有关生物碱结构不同，则离子化程度有所差异。作者经研究首次对有关生物碱进行了鉴定［4］，并对环维黄杨星D有关生物碱进行了吸收系数校正，用HPLC-UV吸收系数校正后归一化法对环维黄杨星D对照品进行含量测定［7］。为了证实该法测定环维黄杨星D对照品含量的可行性，用NMR定量法测定环维黄杨星D对照品并作了比较。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药 岛津LC-10A液相色谱系统（日本岛津公司）；Bruker AV-500核磁共振仪。环维黄杨星D对照品和有关生物碱对照品（黄杨宁）均由南京小营药厂提供；乙腈、甲醇（色谱纯，美国MERCK公司）；水为二次重蒸水；其它试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 HPLC-UV测定法 取经105℃干燥至恒重的环维黄杨星D对照品和有关生物碱对照品（黄杨宁）适量，精密称定，加流动相超声使溶解，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4%磷酸氢二钾溶液（70:30）为流动相；柱温为35℃；检测波长为210nm。精密量取有关生物碱对照品（黄杨宁）溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，应至少有4个主要色谱峰，各峰间的分离度均应符合规定。理论板数按环维黄杨星 D色谱峰计算，应不低于2000。
1.2.2 NMR定量法 取苯甲酸苄酯约10mg，精密称定，置5ml量瓶中，氘代氯仿定容，得2mg·ml-1内标溶液。取环维黄杨星D约4mg，精密称定，置于核磁测定管中，精密吸取内标溶液0.5ml置于上述核磁测定管中，摇匀，采集图谱，测定样品和内标选定峰峰面积得对比值，按内标法计算含量。
2 结果
2.1 有关物质定性 市售黄杨宁原料用高氯酸滴定法测定含量达99%以上,TLC法检查可分出与碘化铋钾试剂呈色的杂质斑点，干燥失重为0，炽烧残渣为0，从TG和DSC曲线可知220℃之前没有失重，说明不含水分与挥发性杂质。以上结果说明供试品中其它杂质亦为生物碱，并且所含碱基单元和分子量与环维黄杨星D相近。
2.2 有关生物碱的结构鉴定 应用制备HPLC对黄杨宁原料进行分离，通过理化方法及光谱分析［4］，主成分结构确证为环维黄杨星D，获得的二个主要有关生物碱，经结构确证分别为环黄杨碱D(Cyclobuxine D)和环常绿黄杨碱C(Cyclovirobuxine C)。见图2。
图2 有关生物碱的结构（略）
A: 环黄杨碱D(C25H42N2O); B: 环常绿黄杨碱C(C27H48N2O)
2.3 环维黄杨星D对照品5种分析方法测定结果比较 5种方法的测定结果见表1，结果基本一致。
表1 环维黄杨星D对照品5种分析方法测定结果（略）
2.4 HPLC-UV色谱图 环黄杨碱D含孤对双键，经检测吸收系数为环维黄杨星D的2.88倍，用峰面积归一化法测定含量时需要对色谱峰4的峰面积进行校正（×0.35）。见图3。
图3 典型l HPLC-UV 色谱图（略）
A: 黄杨宁 ［1,2:未知有关生物碱(tR=5.89, 6.50min); 3: Cyclovirobuxine C(tR=9.45min); 4:黄杨碱D(tR=11.89min); 5:环常绿黄杨碱C(tR=15.78min)］; B: 环维黄杨星D对照品(tR=15.90min)
2.5 1H-NMR图 从一张核磁共振图谱中，我们可以得到三种重要数据：化学位移、偶合常数和共振峰面积。共振峰面积（或峰高）是定量分析的重要参数。共振峰面积或峰高与产生该共振峰的质子数成正比。内标法为NMR定量分析中最常用的方法。见图4。
图4 加苯甲酸苄酯后环维黄杨星D1H-NMR光谱图（略）
A: 全图; B: 局部放大图
按以下公式计算：
Wu=Ws×AuAs×EuEs
（Au：样品定量峰的峰面积；As：内标物定量峰的峰面积；Ws：内标物质精密称重的质量；Eu：样品在定量峰化学位移处的质子当量；Es：内标物质在定量峰化学位移处的质子当量。）
若样品重量为W，则百分含量为：百分含量=（WuW ）×100%。
采用NMR进行定量时应首先对样品的各个质子峰进行归属，明确每个质子峰所对应的质子数。δ4.11ppm, 环维黄杨星D 16-H 共振峰，含有一个质子，不受其它质子产生的共振峰干扰，被选为定量峰。δ5.37ppm处，苯甲酸苄酯苄基氢产生的共振峰，含有两个质子。
3 讨论
3.1 内标物的选择 在NMR定量法中内标是用以定量的依据。选择合适内标的条件：1）最好产生单一共振峰，不受其他峰干扰；2）应能溶于分析溶剂中；3）应有尽可能小的质子当量；4）不应与样品中任何组分发生相互作用。 在常用的几种内标物中，马来酸会与环维黄杨星D生物碱反应，六甲基三硅氧烷质子产生的共振峰会受环维黄杨星D共振峰干扰，最后本试验选择苯甲酸苄酯作为内标。
3.2 两法测定环维黄杨星D含量比较 以上分析已表明环维黄杨星D对照品有较高纯度，仅含少量有关生物碱。有关生物碱环黄杨碱D峰面积已经经过吸收系数校正，HPLC-UV峰面积归一化法可以同时测定环维黄杨星D含量和有关生物碱。NMR方法进行定量分析，具有快速、简便、准确、专属性高的特点，利用内标法或相对比较法，分析混合物中某一化合物时，无需该化合物的纯品作为对照标准，无需克分子吸收数值。实验表明两法均可测定环维黄杨星D的含量，但HPLC-UV法测定环维黄杨星D比NMR定量法更加专属准确、简单经济，因此更适于常规药品检验中环维黄杨星D对照品含量测定。
【参考文献】
［1］ 刘如英. 杨宁片的临床应用［J］.临床内科学杂志，1997，14(2): 112.
［2］ 张开山，吴义元. 黄杨宁片临床应用概述［J］.基层中药杂志，2000，14(4): 52.
［3］ 环维黄杨星D，黄杨宁片，2005年版中华人民共和国药典一部，276，591.
［4］ 刘洁，杭太俊，张正行. HPLC法测定黄杨宁中环维黄杨星D和有关生物碱含量［J］.药物分析杂志，2006，26(4): 446.
［5］ 徐新军，张正行，盛龙生，等. 柱前荧光衍生化法RP-HPLC测定环维黄杨星D含量［J］.药学学报，2002，37(5): 359.
［6］ 徐新军，张正行，盛龙生，等. HPLC/MS法与柱前衍生化HPLC/UV法测定环维黄杨星D有关物质比较［J］.中国药科大学学报，2002，33(5): 408.
作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216； 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 210009