MTHFR基因多态性和酗酒与缺血性脑卒中的相关性

【摘要】  目的 探讨N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性和酗酒与缺血性脑卒中（IS）发病风险的关系。 方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查454例IS患者(病例组)和334例非IS患者(对照组)的MTHFR基因的多态分布，采用非条件Logistic回归模型分析基因型、酗酒情况与缺血性脑卒中发病风险的关系。 结果 酗酒群体的T等位基因的频率显著性升高（P<0.05），患缺血性脑卒中的相对危险度为2.633；而携带有CC基因型则为0.360。相反，非酗酒群体的MTHFR基因的各基因型和等位基因频率的分布与对照组相比，均无显著性差异（P>0.10）。 结论 携带T等位基因的酗酒群体容易患缺血性脑卒中，但携带C等位基因的酗酒群体不容易患缺血性脑卒中，MTHFR基因与酗酒在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用。

【关键词】  缺血性脑卒中 N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶 基因 酗酒

缺血性脑卒中(Ischemic stroke, IS)是严重危害人类健康的疾病，其发病有众多而复杂的遗传和环境因素，基因变异是脑血管病的重要发病因素之一［1,2］。目前，N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetrahydrofolate reductas,MTHFR）基因被普遍认为是研究各类心脑血管疾病转换遗传易感性的主要候选基因之一［3］。MTHFR基因多态性对缺血性脑卒中发病的影响也是近年来研究比较多的题目，但是将两者结合起来分析遗传和酗酒相互作用对缺血性脑卒中的发病影响情况报告还是鲜见，为此我们对N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性和酗酒与缺血性脑卒中发病风险的关系进行了研究。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象  病例组选择2000年9月～2005年3月在中山大学附属第一医院、惠州市中心人民医院及广东药学院第一附属医院神经科和急诊科住院的454例IS患者，其中男271例，女183例；年龄27～94岁，平均(65.20±12.75)岁，有酗酒史57例。所有患者均符合诊断要点［4］，并经临床、CT和(或)磁共振成像(MRI)扫描确诊;对照组选择同期年龄、性别相匹配的其他科住院患者和健康体检者334例，其中男207例，女127例；年龄35～88岁，平均(59.57±16.73)岁，有酗酒史35例。均排除高血压病、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、癌症和肾功能衰竭等。按照统一标准［5,6］将缺血性脑卒中患者和正常对照组分为酗酒群体和非酗酒群体两部分。将每天至少吸一支烟，持续半年以上为酗酒者。

　　1.2  方法

　　1.2.1  人血基因组DNA的提取  取外周静脉血5ml，用肝素抗凝，低渗法破红细胞，分离白细胞，经SDS和蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀提取基因组DNA。

　　1.2.2  MTHFR基因型检测  引物序列：P1：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCG GGA-3’；P2：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’（上海生工），PCR反应体系为30μl，常规配制，94℃预变性5min后，按95℃ 30s，62℃ 45s，72℃ 50s，45个循环周期后补加72℃ 10min。用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳测PCR扩增产物，扩增片段198bp。变性高效液相色谱(DHPLC)法模式鉴定MTHFR基因型，半变性条件下的温度(Tm)为61.7℃。

　　1.3  统计学处理  采用SPSS11.0统计软件。基因型及等位基因相对风险率以比值比（OR）及95%可信区间（CI）表示，采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  MTHFR基因多态类型  PCR扩增出198bp的DNA片段(图1)。经DHPLC法鉴定，在群体中可有CC、CT及TT 3种基因型，CT基因型显示2个峰，而CC和TT基因型标本在单独进样时仅出现单峰；将CC和TT基因型PCR产物混合后再进样，可出现与CT基因型标本类似的双峰(图2)。

　　图1  MTHFR基因PCR扩增结果（略）

　　扩增片段为198bp; M:100bp ladder; 1～5为MTHFR基因PCR扩增产物。

　　Figure 1  PCR Results of MTHFR Gene

　　Size of fragment was 198bp; Marker: 100bp ladder.

　　2.2  MTHFR基因与酗酒在IS发病过程中的协同作用  与对照组相比，酗酒群体的T等位基因的频率显著性升高（P<0.05），它们患缺血性脑卒中的相对危险度为2.633；而携带有CC基因型的酗酒群体患缺血性脑卒中的相对危险度则为0.360。相反，非酗酒群体的MTHFR基因的各基因型和等位基因频率的分布与对照组相比，均无显著性差异（P>0.10），调整年龄、性别、血压、体重指数后，MTHFR基因多态性与酗酒对缺血性脑卒中发生交互作用有显著意义。见表1～2。

　　3  讨论

　　国内外学者对酗酒与缺血性脑卒中之间的关系进行了大量的研究，酗酒作为中青年脑梗死独立的危险因素已得到大量流行病学资料的证实［7,8］，烟草中的焦油、尼古丁及一氧化碳可引起机体一系列变化，导致血压增高、高密度脂蛋白降低和ApoB增高，高ApoB、低HDL能加速动脉粥样硬化的形成，故长期大量酗酒可使脑梗死的发病年龄提前，酗酒是缺血性脑卒中的直接危险因素；而Whisnant等认为,酗酒在致缺血性中风的危险因素随着年龄的增加而降低［9］,可见酗酒对青壮年危害性更大。酗酒可促使肾上腺分泌增加，从而促进血小板的聚集和动脉内皮细胞中的肌球蛋白异常收缩，使细胞间隙扩大，除乳糜微粒以外的其它脂蛋白通过细胞间隙进入内皮下层，并较长时间地停滞于内皮下层，形成动脉粥样硬化病灶。同时酗酒可提高红细胞压积，减少并干扰脑血流，促使血管闭塞；而且酗酒可增加血液粘滞性，对血液流变学有影响［10,11］；酗酒后，可使血栓素A2释放增多，脑血管收缩加强，脑血流减少，还可促进嗜铬细胞释放去甲肾上腺素，使血管收缩，血压增高，持续的高血压促进脑内小动脉壁玻璃样变性、粥样硬化，损害了维持脑血流稳定的动脉自动调节功能，导致动脉内皮损伤和血管狭窄，上述共同作用为栓子滞留和血栓形成具备条件，最终导致缺血性脑卒中［12］。可见，酗酒与缺血性脑卒中有明显的因果关系。亦有研究认为，酗酒是缺血性脑卒中复发的危险因素［13］。

　　图2  DHPLC法鉴定MTHFR基因型(Tm＝61.7℃)结果（略）

　　CT基因型显示为2个峰，CC和TT基因型标本在单独进样时仅出现单峰，而将CC和TT基因型的PCR产物等体积混合后再进样，可出现与CT基因型的标本类似的双峰。

　　Figure 2  Identification MTHFR genotypes by DHPLC (Tm=61.7℃)

　　CT genotype indicated 2 peaks; CC and TT genotype indicated only 1 peak when they are injected alone, but TT genotype show 2 peaks when it was mixed with CC genotype.

　　表1  酗酒群体的MTHFR基因的各基因型分布特征（略）

　　注：#与C等位基因相比

　　表2  非酗酒群体的MTHFR基因的各基因型分布特征（略）

　　注：#与C等位基因相比

　　目前关于基因与酗酒在缺血性脑卒中的发生发展过程中存在协同作用与否的研究不多。本研究结果显示，与对照组相比，酗酒群体的T等位基因的频率显著性升高，它们患缺血性脑卒中的相对危险度为2.633；而携带有CC基因型的酗酒群体患缺血性脑卒中的相对危险度则为0.360。相反，非酗酒群体的MTHFR基因的各基因型和等位基因频率的分布与对照组相比，均无显著性差异，调整年龄、性别、血压、体重指数后，MTHFR基因多态性与酗酒对缺血性脑卒中发生交互作用有显著意义。提示携带有T等位基因的酗酒群体容易患缺血性脑卒中，而携带有C等位基因的酗酒群体不容易患缺血性脑卒中，MTHFR基因与酗酒在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用，这与既往的研究［5,14］结果一致。
MTHFR基因与酗酒在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用的机理尚不明。MTHFR基因可能通过影响动脉粥样硬化从而引起缺血性脑卒中，而酗酒亦可以促使动脉粥样硬化，故它们可能在动脉粥样硬化这一环节上起协同作用。因此，通过戒酒，尤其是对于携带有危险基因型的群体（如TT基因型），也许可以降低缺血性脑卒中的发生、发展，甚至复发。

【参考文献】
  　　［1］ Dominiczak AF, McBride MW. Genetics of common polygenic stroke［J］. Nature Genetics, 2003,35(2):116～117.

　　［2］ 张成,刘焯霖.重视脑血管病的遗传学研究［J］.中华神经科杂志, 1999,32(5): 262～264

　　［3］ Kostulas K, Crisby M, Huang W X, et al. A methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism in ischaemic stroke and in carotid artery stenosis［J］. Eur J Clin Invest, 1998, 28(4):285～289.

　　［4］ 王新德.各类脑血管病诊断要点［J］.中华神经科杂志,1996,29(6):379～380.

　　［5］ Pezzini A, Grassi M, Zotto ED, et al. Cumulative effect of predisposing geno- types and their interaction with modifiable factors on the risk of ischemic stroke in young adults［J］. Stroke, 2005, 36(3):533～539.

　　［6］ 杨政权,汪培山.酗酒、饮酒与脑出血的配对病例对照研究［J］.疾病控制杂志,1999, 3(2):101～102.

　　［7］ Love BB, Biller J, Jones MP, et al. Cigarette alcohol abuse. A risk factor for cerebral infarction in young adults［J］. Arch Neurol,1990, 47(6):693～698.

　　［8］ 牛小媛,李阳,杨旭,等.中青年脑梗死危险因素的Logistic回归分析［J］.中国慢性病预防与控制,2003,11(3):102～104.

　　［9］ Whisnant JP, Wiebers DO, O’Fallon WM, et al. A population-based model of risk factors for ischemic stroke［J］. Neurology, 1996, 47(6):1420.

　　［10］ 林申强,吴丛菊,姚东华.烟酒与青壮年脑梗塞关系的探讨［J］.菏泽医专学报, 2000, 12(2):22～23.

　　［11］ 王凯,何群,严庆惠.长期酗酒对脑梗塞患者血液流变学等参数的影响［J］.中国老年学杂志,2002,22(1):56～57.

　　［12］ 梁酉,雷启庄.酗酒与脑血管病的关系［J］.卒中与神经疾病杂志,1998,5(4):236～237.

　　［13］ 林耀波,解龙昌,王新.脑梗死复发的危险因素分析［J］.广东医学,2004,25(3): 172～173.

　　［14］ Szolnoki Z, Somogyvari F, Kondacs A, et al. Evaluation of the modifying effects of unfavourable genotypes on classical clinical risk factors for ischaemic stroke［J］. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2003, 74(12):1615～1620.

作者单位：中山大学附属第一医院神经科,广东 广州 510080； 惠州市中心人民医院,广东 惠州 516001； 海南省农垦总局医院,海南 海口 570311； 广东药学院第一附属医院神经科,广东 广州 510080