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【摘要】 目的 建立测定乳香挥发油(BCBV)脂质体包封率的方法。 方法 采用石油醚萃取—紫外法测定乳香挥发油脂质体的包封率。 结果 乳香挥发油在307nm附近有最大吸收峰,浓度在41.36~310.20μg·ml-1范围内与吸光度A呈良好的线性关系,精密度良好(RSD=0.3%),低、中、高三个浓度的乳香挥发油溶液平均回收率均符合规定,分别为98.5%、99.3%、98.1%。 结论 各项方法学考察指标均符合规定,适用于乳香挥发油脂质体包封率的测定。
【关键词】 乳香挥发油 脂质体 包封率 萃取 紫外法
中药乳香能活血行气、通经止痛、消肿生肌。现代药理研究证明,乳香提取物能诱导急性非淋巴细胞白血病细胞和急性粒细胞白血病细胞株HL60分化和凋亡,能诱导急性单核细胞白血病细胞株U937及急性粒细胞白血病原代细胞凋亡[1]。然而,乳香挥发性成分具有严重的胃肠道刺激作用,口服给药病人的顺从性差而导致治疗的失败。本研究将乳香挥发油(以下简称为BCBV)制成脂质体剂型,具有肝靶向性、掩盖不良气味、提高药物稳定性和延长作用时间等优点。
包封率是脂质体制剂的重要质量控制指标之一。脂质体包封率的测定方法较多,但实验表明,传统的包封率测定方法并不合适乳香挥发油脂质体。本实验通过对萃取法分离游离药物的方法进行了考察,建立了萃取—紫外法测定乳香挥发油脂质体包封率的分析方法。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂 UV-2450型分光光度计(日本岛津),乳香挥发油(自制),其余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 测定方法 精密吸取适量空白脂质体,加甲醇破乳、定容,作为空白液;另精密吸取适量BCBV脂质体,加甲醇破乳、定容,在307nm波长处测UV,标记为A1;再精密吸取同体积BCBV脂质体,加同体积石油醚萃取三次,将下层脂质体层加甲醇破乳、定容,在307nm波长处测UV,标记为A2。由公式E%=A2/A1×100,计算得到BCBV脂质体的包封率。
1.2.2 方法学考察[1,2]
1.2.2.1 乳香挥发油紫外测定波长的确定 配制一定浓度的乳香挥发油甲醇溶液,在200~400nm波长范围内进行扫描。
1.2.2.2 专属性 吸取适量空白脂质体,加入一定量甲醇,手摇破乳,在200~400nm波长范围内进行扫描。
1.2.2.3 线性范围 取乳香挥发油适量,精密称定,加甲醇溶解,制成517μg·ml-1的乳香挥发油标准储备液。分别精密吸取乳香挥发油标准储备液0.8、1、2、4、6ml于10ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,得到浓度分别为41.36、51.70、103.40、206.80、310.2μg·ml-1的一系列标准溶液,分别于307nm处测定吸光度A。
1.2.2.4 精密度试验 配制一定浓度的乳香挥发油甲醇溶液,于307nm波长处连续测定吸光度A(n=6),计算RSD%。
1.2.2.5 空白脂质体回收率 吸取适量的空白脂质体,加入一定量甲醇,手摇破乳,在200~400nm波长范围内扫描;另精密吸取同样量的空白脂质体,加同体积石油醚萃取三次,将下层空白脂质体同上操作,在200~400nm波长范围内扫描。
1.2.2.6 乳香挥发油的回收率 精密称取不同量的乳香挥发油,加石油醚制成低、中、高三个浓度的乳香挥发油溶液,分别于307nm波长处测定吸光度A1(n=3);另精密称取低、中、高同样量的乳香挥发油,分别加适量空白脂质体,用同体积的石油醚萃取3次,将石油醚层吸至10ml容量瓶中,加石油醚至刻度,分别于307nm波长处测定吸光度A2(n=3)。
1.2.2.7 乳香挥发油在空白脂质体中的回收率 精密称取不同量的乳香挥发油,加甲醇制成低、中、高三个浓度的乳香挥发油溶液,分别于307nm波长处测定吸光度A1(n=3);另精密称取低、中、高同样量的乳香挥发油,分别加适量空白脂质体,甲醇定容,以同浓度的空白脂质体甲醇溶液为对照液,分别于307nm波长处测定吸光度A2(n=3)。
2 结果
2.1 乳香挥发油紫外测定波长的确定 乳香挥发油在200~400nm波长范围内的吸收光谱见图1,结果表明,乳香挥发油在307nm附近有最大吸收峰。
Fig 1 UV absorption spectra of BCBV in CH3OH(略)
2.2 专属性 UV图谱显示,空白脂质体在307nm附近没有吸收峰,但有一定的吸收度,为了减少误差, 选择空白脂质体作为对照液,消除其对测定结果的干扰。
2.3 线性范围 乳香挥发油浓度在41.36~310.20μg·ml-1范围内与吸光度A呈良好的线性关系,符合比尔定律,回归方程为:A=0.0035C+0.0033(R2=1,n=5)。
2.4 精密度试验 计算精密度RSD=0.3%,表明精密度良好。
2.5 空白脂质体回收率 UV扫描图谱表明,经过石油醚萃取处理前后的空白脂质体,其紫外图谱没有显著差异,表明脂质体经过萃取不破坏其双分子层结构及化学成分。
2.6 乳香挥发油的回收率 乳香挥发油的回收率的结果见表1。结果表明,低、中、高三个浓度的乳香挥发油溶液的平均回收率均符合规定。
表1 乳香挥发油的回收率(略)
Tab 1 The recovery of BCBV
2.7 乳香挥发油在空白脂质体中的回收率 乳香挥发油在空白脂质体中的回收率结果见表2。结果显示,低、中、高三个浓度的乳香挥发油溶液在空白脂质体中的平均回收率均符合规定。
表2 乳香挥发油在空白脂质体中的回收率(略)
Tab 2 The recovery of BCBV in blank liposomes
3 讨论
3.1 目前,脂质体的分离方法主要有透析法[3,4]、凝胶柱法、离心法、微柱法、超滤法[5,6]等。其中,柱层析法中最常用的凝胶是Sephadex-G型,属于水溶性凝胶。透析法中常用的透析介质为水溶液。乳香挥发油为挥发油,脂溶性强,故不适宜采用柱层析法、透析法和微柱离心法。在处方前研究中测得乳香挥发油的比重为1.0343g·ml-1,比重比水稍大,因此也不能采用离心法来分离游离药物和含药脂质体。本实验考虑到乳香挥发油脂溶性强,尝试采用有机溶剂萃取法,参考相关文献[2],考察了石油醚和乙醚两种有机溶剂,结果显示,乙醚对脂质体有破乳作用,而石油醚则不会溶解脂质体,故选定石油醚为萃取溶剂。萃取法分离脂质体的方法学考察中应该考察的方面有以下3点:①石油醚能否完全萃取出乳香挥发油;②石油醚对脂质体的双分子层结构是否有破坏作用;③在空白脂质体中,石油醚能否完全萃取出乳香挥发油。考察的结果表明,用石油醚萃取法分离游离药物和含药脂质体的方法是确实可行的。
3.2 乳香挥发油为总挥发油,目前暂无对照品可用来做定量研究。参考相关文献[2],在紫外分光光度法测定包封率方法中,在考察范围内,挥发油浓度C与吸光度A值的线性关系良好,精密度和回收率符合要求,因此认为在乳香挥发油成分暂无对照品的情况下,用吸光度A值来代替其浓度C的相对大小进行工艺研究是可行的。
【参考文献】
[1] 崔锐,周金云.乳香化学和药理的研究进展[J].中国药学杂志,2003,38 (6):407~410.
[2] 禹玉洪,李雪春,吴涛,等.注射用柴胡挥发油脂质体制备工艺研究[J].中国中药杂志,2004,29(6):521~525.
[3] Henriksen I,Sande SA,Smistad G,et al. In vitro evaluation of drug release kinetics from liposomes by fractional dialysis[J].Int J Pharm,1995,1119(2):231~238.
[4] Lasic D.D,Ceh B,Stuart MCA,et al.Transmembrane gradient driven phase transition within vesicles: lessons for drug delivery[J].Biochem Biophys Acta,1995,1239:145~156.
[5] Liu FY,Saho Z,Dildsig DO.Pulmonary delivery of free and liposomal insulin[J].Pharm Res,1993,10(2):228~232.
[6] Satish R.Comparative study of separation of non-encapsulated drug from unilamellar liposomes by various methods[J].Pharm Pharmcol,1996,48:1112~1115.
作者单位:海南医学院药学系,海南 海口 571101; 中南大学药学院,湖南 长沙 410013