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【摘要】 目的 分析以羊水细胞进行胎儿ABO血型基因分型及其可行性分析。 方法 妊娠16周孕妇抽取羊水，从羊水细胞中提取DNA，采用PCR-SSCP技术，通过PCR反应，特异性扩增ABO基因片段，用凝胶电泳检测PCR产物，SSCP硝酸银染色，PCR产物直接测序等分子生物学方法，直接鉴定ABO血型基因型。 结果 15例高抗体效价的O型孕妇中丈夫A型的9例，B型5例，AB型1例，胎儿羊水细胞基因定型血型与末梢血血型吻合。 结论 通过羊水细胞，采用PCR-SSCP技术，进行胎儿ABO血型基因定型的方法是可行的。
【关键词】 羊水细胞 ABO血型 基因定型
ABO新生儿溶血病是由于母婴血型不合，母体内缺乏胎儿红细胞抗原，当胎儿红细胞通过胎盘进入母体循环，因抗原性不同使母体产生相应血型抗体（抗A抗B抗体），此抗体又经胎盘进入胎儿血液循环，与胎儿红细胞抗原凝集，使之破坏，导致溶血。该病可发生于胎儿和早期新生儿，是最常见的新生儿溶血病［1,2 ］。 抗A 抗B抗体除有IgG免疫性抗体外，也有属于IgM的天然抗体，所以，胎儿血型的研究十分重要。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 正常宫内妊娠，高效价抗A抗B抗体，丈夫为A型、B型或AB型的O型孕妇。
1.1.2 婴儿组 胎儿期做了血型基因定型的婴儿，做血清学血型鉴定作为对照组。
1.2 实验方法
1.2.1 样品采集 孕妇妊娠16周抽取羊水，酚/氯仿提取DNA。 婴儿扎手指采末梢血。
1.2.2 PCR引物由美国G＆T Biotech 公司合成。
1.2.3 PCR反应 反应体系9μl，含PCR引物混合物7μl，已稀释的Taq酶1μl，DNA样品1μl，石蜡油覆盖PCR反应液。采用热启动方法，先将PCR扩增仪预热到95℃后，再放入PCR反应管，维持95℃预变性5min，依下列程序进行30个循环：(1)95℃变性30秒;(2)60℃退火30秒;(3)72℃延伸90秒。30个循环后置72℃再延长5min，降温至4℃。
1.2.4 PCR产物检测 使用0.5×TBE缓冲液，配置2％琼脂糖凝胶，取6～7μl PCR产物直接点样到凝胶孔中，DNA长度标记点样4μl，10V/cm电泳20～30min，在紫外灯下拍照记录。单链构象多态性分析（SSCP）：扩增产物10μl，加上样液13μl（甲酰胺10μl，0.25%溴酚蓝3μl)，混匀，94℃变性5min，迅速取出放置于冰浴中，取15μl上样，10%聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶，0.5×TBE缓冲液，4℃进行电泳15h，硝酸银染色显色，美国UVIpro凝胶成象分析系统拍照，并记录结果。 PCR产物直接测序：以r-32P-ATP末端标记5’端引物，95℃、55℃、72℃各30s，共30个循环周期后行测序凝胶电泳。
1.2.5 PCR结果分析 每个PCR反应都有强弱不一的207bp内对照产物，根据产生的特异性产物来指定相应的基因型，不同的基因型可以对应同样的表型：
A: PCRMix 75bp片段PCR产物检测到21个等位基因
A201: PCRMix 117bp片段PCR产物检测到7个等位基因
B: PCRMix 90bp片段PCR产物检测到17个等位基因
O: PCRMix 127bp片段PCR产物检测到33个等位基因
1.2.6 婴儿组婴儿扎手指采末梢血,应用血清学方法,进行婴儿血型鉴定，作为胎儿血型基因定型的对照。
2 结果
孕妇组15例羊水细胞DNA扩增，电泳所见的基因条带清晰,基因型对应的表型与婴儿组血清学血型鉴定吻合,差异无显著性(P>0.05)。另外偶有扩增产物弱,可能是项目刚启动的缘故，随着实验研究的深入进行,实验将会得到更完善的发展。PCR反应、基因型对应表型见表1。
表1 PCR反应及相应的基因型和表型（略）
3 讨论
母婴血型不合以ABO血型较多见，是我国新生儿溶血病的主要原因，也是高胆红素血症常见的原因。有资料报道，由本病所致死胎占0.3％，新生儿期死亡率占1.4％。在母婴血型不合中，ABO血型不合约占85.3％，Rh血型不合约占14.6％，MN血型不合约占0.1％。母婴血型不合可导致胚胎停育、胎儿畸形、流产、早产、死胎和新生儿溶血病，也可造成生后患儿智力低下和神经系统运动障碍等后遗症［3］。为对此病进行早期诊断，避免严重后遗症的发生，预防新生儿溶血病，产前确定胎儿血型十分必要。
由于母儿血型不合可导致不良妊娠结局，临床工作中常用检测母体血型抗体滴度来预测ABO血型不合、溶血发生的可能性，但由于自然界类抗原的存在，及O型血母亲与父亲为A或B型杂合子时，则有50％胎儿为A或B型。说明尚可能有50％胎儿与母亲血型相同，因此仅凭抗体滴度进行ABO母儿血型不合溶血症的预防和治疗，存在一定的盲目性，故胎儿血型产前基因诊断有着重要的临床意义。
羊水中的羊水细胞和胎儿脐血细胞都含有胎儿血型物质和DNA。曾有报道用血清学方法鉴定羊水细胞的ABO血型，但胎儿及新生儿细胞携带A、B、H抗原主要是线形寡糖，线形寡糖只有一个末端可结合H特异性糖，再结合A和B特异性糖，所以抗原反应性弱，用血清学方法可能出现无凝集现象，影响血型定型结果。PCR-SSCP方法检测ABO基因型是利用ABO基因发生突变位点的不同核苷酸分别设计一系列序列特异引物，直接扩增ABO 基因型的DNA 片段，从而测得ABO血型及其亚型［4］。国内有利用PCR-SSCP技术在成人血细胞中测定ABO血型基因型的报道。目前国内应用PCR-SSCP方法对羊水细胞、脐血细胞进行胎儿ABO基因分型报道尚少［5,6］。
本研究通过抽取孕妇羊水，从羊水中的白细胞提取DNA，进行PCR，电泳，以及PCR-SSCP，PCR产物直接测序等分子生物学方法，直接鉴定ABO血型基因型。该项目在国外已有一定的研究，在国内已经起步。实际上，本项目具有一定的社会和经济效益，备受O型孕妇的关注，是她们期待着的项目，具有良好的发展前景。
开展这项研究对于抗A抗B效价高的O型孕妇十分有意义。如果孕妇抗A效价高于64，胎儿血型为A型，那么胎儿或新生儿就有发生ABO溶血的风险，抗体效价越高风险越大，这时使用中药合理治疗则可避免胎儿新生儿溶血病的发生。如果孕妇抗A抗B效价高，而胎儿是O型，则不会发生新生儿溶血，不需要药物治疗高效价抗体，可以避免不必要的药物损害和经济损失，也可避免一些纠纷。虽然抽羊水也有一定的风险，但是我院开展产前诊断工作多年，经验丰富，技术娴熟，责任心强，能胜任此项工作,能把它做好。
【参考文献】
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作者单位：深圳市妇幼保健院,广东 深圳 518028