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【摘要】 目的 寻找在鼻咽癌发病过程中起着重要作用的关键癌基因或抑癌基因。 方法 利用基因芯片比较混合的鼻咽癌细胞株与非鼻咽癌组织之间的差异表达基因,并以生物信息学的方法，寻找癌基因和抑癌基因,以半定量RT-PCR和免疫组化分析鉴定重要癌基因或抑癌基因表达结果的可靠性。 结果 鼻咽癌细胞中表达上调比较明显的BIRC5基因在凋亡抑制信号通路中起着重要的作用，参与鼻咽癌的发病过程。半定量RT-PCR分析显示BIRC5 mRNA在肿瘤组中表达明显上调;免疫组化检测78个非癌鼻咽组织和82个鼻咽癌组织，Mann-Whitney test统计分析发现，与非癌鼻咽组织相比，BIRC5蛋白在鼻咽癌组织中表达明显上调（P<0.001）。 结论 BIRC5参与了鼻咽癌发病过程，其表达上调可能促进鼻咽癌的发病,但是否与转移、预后及复发等临床参数相关还有待进一步研究。
【关键词】 鼻咽癌 基因芯片 BIRC5 半定量RT-PCR 免疫组化
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程，高发于我国南方省份及东南亚等一些地区和国家，具有明显的种族聚集性和地域性。EB病毒(EBV)、化学致癌物构成NPC的主要病因，而发病阶段至少在二个以上。各种环境因素、EBV感染和遗传及表遗传学的改变导致瘤基因过表达及抑瘤基因表达上调或缺失，经过癌前病变，终至发展成为鼻咽癌。在以往研究中，鼻咽癌染色体的扩增和缺失已经被报道发生在几乎所有人类染色体。3p21.2-21.33在鼻咽癌中是高频缺失区域之一，抑癌基因RASSF1A和BLU位于这个区域。与之相反，染色体12q13.11-14.1和11q12.3-13.5是两个高频扩增区域，癌基因MDM2［1,2］和CCDN1［3,4］分别位于这两个区域，其扩增频率在鼻咽癌中各自为35.11%和16%，免疫组化证实这两个基因在鼻咽癌中的高表达。尽管肿瘤遗传学的进展使得一些鼻咽癌相关基因作用得到了鉴定，但这些基因仍远不足以全面阐明鼻咽癌发病机制,因此，鼻咽癌相关基因的揭示仍将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理及预后。
本研究为了寻找重要的鼻咽癌相关基因，准备利用8000人的基因芯片，比较混合的鼻咽癌细胞系和非癌鼻咽组织之间的差异表达基因，并利用生物信息学寻找重要的癌基因或抑癌基因，从而为揭示鼻咽癌的发病机理提供重要的线索。
1 材料与方法
1.1 细胞系培养 CNE2低分化鼻咽癌细胞系，由中国医学科学院建立;5-8F和6-10B低分化鼻咽癌细胞系，由中山医科大学肿瘤研究所建立。三种细胞的生长培基为1640+10% NBCS，细胞呈上皮样，贴壁生长，其中5-8F细胞还具有高转移能力。
1.2 标本收集 24例鼻咽非癌标本，来自于广东省江门市中心医院和湖南省肿瘤医院;鼻咽癌与非癌鼻咽病理切片来自于广东省中山市人民医院。
1.3 RNA样品提取 常规Trizol提取非癌鼻咽组织和细胞总RNA。随后，RNA经QIAgene RNeasy mini kit纯化（方法见试剂盒说明）。 最后将离心柱放入一个新的样品收集管，向离心柱中加入100μl DEPC水，12 000转离心1min；再次加入100μl DEPC水，以最12 000转离心1min，合并两次的滤过液。加入2.5倍体积无水乙醇和1/10体积的3M乙酸钠，混匀后室温静置30min，4℃，13 000rpm，15min，弃上清，加入1ml 75%乙醇悬起沉淀, 12 000rpm×5min，弃上清, 重复洗1次，室温晾干，加入30μl DEPC水溶解沉淀，测定RNA样品浓度和总量。琼脂糖凝胶电泳鉴定-80℃保存。
1.4 芯片杂交 混合鼻咽癌细胞系和鼻咽组织在逆转录过程中分别用Cy3标记和Cy5标记。将标记好的探针(Cy3/Cy5)按等量混匀(各40pmol), 抽干后，按顺序加入下列试剂：4X杂交缓冲液7.5μl，甲酰胺15μl，加灭菌水至总体积30μl。充分溶解并混匀后短暂离心，95℃水浴5min，立刻置于冰上1min，振荡混匀后短暂离心，将混好的探针铺在基因芯片有样品的一侧，然后再将盖玻片放上，并放置于42℃孵箱中16h。杂交结束后，洗涤干燥。将芯片放入扫描片夹中，利用扫描仪进行扫描；扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号, 随后进行数据分析和处理。差异表达基因筛选标准：荧光信号强度大于5×108，差异表达值大于2或小于0.5倍作为有意义表达基因。
1.5 生物信息学分析 根据MILANO［5］网站分析,将差异表达基因输入Primary Search Term 框内，然后将Oncogene和Tumor suppressor输入到Secondary Search Term 框内，搜索Pubmed整个数据库，结果以E-mail的形式反馈到邮箱内。输出结果为一张表格，含有每一对搜索术语击中的次数，并以超连接的方式指向PubMed。该结果较为准确的能找到所需要的文献，并能节省许多时间和精力。
1.6 半定量RT-PCR 利用设计的引物在鼻咽癌细胞及正常鼻咽组织扩增BIRC5基因,反应体系为 0.8μl 20pmol 上下游引物(各0.4μl), 1.6μl 2.5mM dNTP, 2μl PCR buffer, 0.4μl(2U) Taq (TaKaRa. Inc),1μl cDNA 模板和14.2μl灭菌去离子水共20μl。 反应条件如下: 94℃变性2min; 94℃变性30s; 55℃退火40s, 72℃延伸45s,27个循环；最后，产物在72℃延伸10min。 ACTG基因作为内参照（279bp），除了PCR设置为23个循环外，其余的PCR反应体系和反应条件相同。数据分析是以ACTG表达水平为基准校正目标基因的相对表达水平，实验样品与对照样品的表达变化比值则以两者的相对表达水平进行比较。
1.7 免疫组化及结果判定 利用免疫组化检测了82例鼻咽癌组织和78例非癌鼻咽组织。用二甲苯将5mm的石蜡切片脱蜡，梯度乙醇入水，然后浸泡于10mM的柠檬酸盐缓冲液里95℃ 15min抗原微波修复。以BIRC5抗体(1:200稀释, 博士德公司)室温孵育30min。清洗后依次用辣根过氧化物酶耦联，DAB显色，苏木素复染后封片，显微镜观察。细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，阳性染色位于胞浆。表达水平采用染色强度评分和阳性细胞数评分的综合评分方法进行记分。染色强度分4级：0分为完全阴性，与背景一致；1分为弱阳性染色信号，淡黄色略高于背景；2分为阳性染色信号，呈棕黄色，明显高于背景；3分为强阳性染色，呈棕黄色。阳性细胞数也分4级：0分为阳性细胞数小于10％；1分为阳性细胞数10％～25％，2分为阳性细胞数25％～50％；3分为阳性细胞数≥50％。每张细胞片或切片表达量计分用下列公式表示：蛋白表达量综合计分＝染色强度计分+阳性细胞数计分。依照综合计分0为表达阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（++），5～6分为强阳性（+++），结果用SPSS软件进行Mann-Whitney 检验。
2 结果
2.1 RNA提取 提取鼻咽癌组织和细胞Total RNA，可见28s和18s带完整，28s带是18s带亮度的2倍。见图1。
图1 5-8F、6-10B、CNE2和正常混合鼻咽组织总RNA 1％琼脂糖电泳图（略）
1:5-8F; 2:6-10B; 3:CNE2; 4:非癌鼻咽组织
2.2 基因芯片及生物信息学分析 基因芯片分析结果显示，842个基因差异表达。其中386个基因表达上调，456个基因表达下调。将这些差异表达基因经MILANO分析后，找到21个已知癌基因和抑癌基因。其中癌基因BIRC5在鼻咽癌细胞中表达明显上调，差异倍数为6.2。与oncogene相关的文献在Pubmed数据库中共收搜到262篇论文，表明该基因在肿瘤发病过程中发挥重要的作用。
2.3 半定量RT-PCR 半定量RT-PCR结果显示，与非癌鼻咽组织相比，BIRC5 mRNA在鼻咽癌细胞中明显高表达，依次差异表达倍数为4.7、4.3和5.2倍。见图2。
图2 半定量RT-PCR鉴定BIRC5在鼻咽癌细胞与非癌鼻咽组织中差异表达（略）
2.4 免疫组化 免疫组化显示，在正常鼻咽粘膜，BIRC5显示弱阳性，而在鼻咽癌组织中着色很深，呈强阳性表达。结果用Mann-Whitney统计检验分析显示，BIRC5基因在鼻咽癌组织中表达明显上调（P<0.001）。见表1。
表1 BIRC5在鼻咽癌与正常咽粘膜中的表达（略）
3 讨论
鼻咽癌发病是一个多阶段、多途径、多机制的过程，涉及大量相关基因的参与。而基因芯片技术的出现为筛选重要的差异表达基因提供了良好的平台。随着近年来基因芯片技术不断成熟，筛选的结果也不断的变得稳定。尽管鼻咽癌研究已经取得了一定的进展，但这些工作远不能揭示其发病机制，需要不断的挖掘鼻咽癌发病相关基因。本研究中，我们利用基因芯片技术，比较鼻咽癌细胞系和正常鼻咽之间的差异表达基因，并利用在线MILANO分析程序，找到一个重要的癌基因BIRC5在鼻咽癌细胞中明显上调。随后，我们分别利用半定量RT-PCR和免疫组化证实分别证实了BIRC5基因mRNA在鼻咽癌细胞和蛋白在鼻咽癌组织中表达上调（P<0.001）。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族IAPs（Inhibitor of apoptosis proteins）中结构最简单，抗凋亡作用最强的蛋白分子，含有四个外显子和三个内含子，只含有一个杆状病毒IAP重复序列（Baculoviral IAP repeats，BIRs），BIR结构主要起抗凋亡作用。凋亡抑制蛋白BIRC5主要涉及到两个重要的生物学功能: 促进细胞增殖以及调整细胞的生存时间。其抑凋亡作用是通过抑制凋亡通路下游的caspase-3和caspase-7而发挥作用的。近期研究表明，抗凋亡基因Survivin表达于多种肿瘤组织，包括了前列腺癌［6］、乳腺癌［7］、乳头状膀胱上皮癌［8］、腹膜间皮瘤［9］、肝癌［10］等，并且与这些肿瘤的病理分级、临床分期、转移、复发及多药耐药相关。目前针对BIRC5进行RNAi研究已经开展了许多，靶向SiRNA不但能抑制胶质瘤U251细胞的生长和血管形成［11］，而且也能抑制肝癌［12］以及乳腺癌的生长［13］等。以上表明，BIRC5基因表达上调可能在鼻咽癌的起始和进展中起着重要的作用，并有可能与鼻咽癌的转移、预后及转归相关，但还需要有待进一步证实。
【参考文献】
［1］ Luo JL, Xiao JY, Tian YQ. MDM2 gene amplification and overexpression in nasopharyngeal carcinoma［J］. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2000,25(1):18～20.
［2］ Luo JL,Xiao JY,Tian YQ, et al. MDM2 gene expression and the relationship between MDM2 gene and P53 protein expression in nasopharyngeal carcinoma［J］. China Journal of Modern Medicine,1999,9(10):3.
［3］ Xie L, Xu L, He Z, et al. Identification of differentially expressed genes in nasopharyngeal carcinoma by means of the Atlas human cancer cDNA expression array［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2000,126(7):400～406.
［4］ Zhu H,Zeng L,Xie ZH, et al. Immunohistochemical study on expression of Cyclin D1 and Cyclin B1 in nasopharyngeal carcinoma［J］. China Journal of Modern Medicine, 2004,14（11）:103～5.
［5］ Rubinstein R, Simon I. MILANO--custom annotation of microarray results using automatic literature searches［J］. BMC Bioinformatics, 2005,6(1):12.
［6］ Koike H, Sekine Y, Kamiya M, et al. Gene Expression of Survivin and Its Spliced Isoforms Associated with Proliferation and Aggressive Phenotypes of Prostate Cancer［J］. Urology, 2008,10 ［Epub ahead of print］
［7］ Nassar A, Sexton D, Cotsonis G, et al. Survivin Expression in Breast Carcinoma: Correlation With Apoptosis and Prognosis［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008,8:［Epub ahead of print］
［8］ Chen YB, Tu JJ, Kao J, et al. Survivin as a useful adjunct marker for the grading of papillary urothelial carcinoma［J］.Arch Pathol Lab Med, 2008,132(2):224～231.
［9］ Zaffaroni N, Costa A, Pennati M, et al. Survivin is highly expressed and promotes cell survival in malignant peritoneal mesothelioma［J］.Cell Oncol, 2007,29(6):453～466.
［10］ Chau GY, Lee AF, Tsay SH, et al. Clinicopathological significance of survivin expression in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Histopathology, 2007,51(2):204～218.
［11］ Zhen HN, Li LW, Zhang W, et al. Short hairpin RNA targeting survivin inhibits growth and angiogenesis of glioma U251 cells［J］.Int J Oncol, 2007,31(5):1111～1117.
［12］ Miao GY, Lu QM, Zhang XL. Downregulation of survivin by RNAi inhibits growth of human gastric carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol, 2007,13(8):1170～1174.
［13］ Guan HT, Xue XH, Wang XJ, et al. Effects of siRNA targeted to survivin in suppressing proliferation and inducing apoptosis in breast cancer MCF-7 cells［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2006,28(5):326～330.
作者单位：中山大学附属中山医院病理科,广东 中山 528403; 南方医科大学肿瘤研究所,广东 广州 510000