点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨血红蛋白和肝素对荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）的影响。 方法 采用沉淀煮沸裂解法提取含不同浓度血红蛋白或肝素的血浆标本中的HBV DNA，应用FQ-PCR方法对HBV DNA 进行定量检测。 结果 血浆标本中血红蛋白浓度<37g/L或肝素浓度<62.5U/ml时，对HBV DNA的定量结果无明显影响，但当肝素浓度达到125U/ml以上时，PCR反应明显受到抑制。 结论 对轻微的溶血和使用常规浓度肝素抗凝的血浆标本，可采用沉淀煮沸裂解法提取HBV DNA进行FQ-PCR定量检测。
【关键词】 血红蛋白 肝素 荧光定量聚合酶链反应技术
HBV DNA的定量检测作为判断乙肝病毒在体内是否复制、选择治疗方案和观察疗效的重要指标［1］,日益受到重视。目前对HBV DNA 进行定量检测大多采用基于Taqman 技术［2］的FQ-PCR方法。研究表明, 血红蛋白中的血红素可通过其卟啉环与Taq 酶的不可逆结合而抑制Taq 酶活性,导致检测结果降低［3,4］。此外，有学者认为肝素作为Taq 酶的强抑制剂,在核酸提取步骤中难以去除［5］,从而影响定量结果的准确性。因此，临床上均要求用于HBV DNA定量检测的标本不得使用肝素抗凝和避免溶血。而在日常工作中因误用肝素抗凝和因穿刺而造成标本溶血，致使退回重新采样的情况时有发生，给工作人员及患者带来不便。本文采用FQ-PCR技术对含不同浓度血红蛋白或肝素的血浆标本进行HBV DNA定量检测，对沉淀煮沸裂解法去除血红蛋白和肝素的能力进行评价，旨在建立和完善实验室的标本采集和处理程序。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 iCycler荧光定量PCR仪来自美国BIO-RAD公司；HBV DNA荧光定量PCR试剂盒购自深圳匹基基因诊断技术有限公司，试剂批号：20070501；乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）和肝素锂一次性使用真空采血管由广东阳普医疗用品有限公司生产, 批号:070727和070703，产品执行标准:YY0314；肝素钠注射溶液购自江苏万邦生化医药有限公司，药品批号：0706131，规格：125 000U：2ml。
1.2 肝素锂和EDTA-K2抗凝血对比实验 20份病例均为本院感染科住院的慢性乙型肝炎患者(符合2000年全国病毒性肝炎会议诊断标准)。空腹分别用EDTA-K2和肝素锂抗凝一次性真空采血管抽取静脉血2ml，离心后分离血浆，采用沉淀煮沸裂解法提取HBV DNA，每份样本作3管平行实验。
1.3 模拟溶血和肝素抗凝实验
1.3.1 HBV DNA阳性样本的制备 取数份上述慢性乙型肝炎患者EDTA-K2抗凝血浆混合而成。用灭菌蒸馏水作1∶1混合作为对照组。
1.3.2 模拟溶血标本的制备 取一份正常体检者EDTA-K2抗凝全血标本，（乙型肝炎血清学指标HbsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HBcAb 全阴者）,离心去血浆后，用生理盐水将红细胞洗涤数遍,加入灭菌蒸馏水溶解红细胞，测定血红蛋白浓度，然后用灭菌蒸馏水对倍稀释成一系列梯度浓度的血红蛋白溶液。将上述HBV DNA阳性样本与其作1∶1混合，得到HBV DNA含量相同而血红蛋白终浓度不同的模拟溶血标本。
1.3.3 模拟肝素抗凝标本的制备 先用灭菌蒸馏水将注射用肝素钠溶液调节成初始浓度为2 000U/ml的肝素溶液，然后用灭菌蒸馏水对倍稀释成一系列梯度浓度肝素溶液。将上述HBV DNA阳性样本与其作1∶1混合，得到HBV DNA含量相同而肝素终浓度不同的模拟肝素抗凝血标本。
1.4 核酸提取 100μl上述各样本 ,分别加入100μl 核酸提取液1（沉淀剂），振荡混匀后于13 000rpm 离心10min ,尽量吸弃上清,于沉淀中加入25μl核酸提取液2（裂解液） ,充分振荡至沉淀完全溶解后，100℃干浴10min,13 000rpm离心10min ,留上清作为HBV DNA模板提取液备用。上述每份样本均作3管平行实验，所有实验均在同一批进行。
1.5 核酸扩增 PCR 扩增反应体系共40μl，包括36.4μl PCR 反应液、0.4μl Taq酶和0.06μl UNG 和2μl的模板提取液。扩增循环条件设置为37℃ 5min，94℃ 1min ，再按95℃ 5s、60℃ 30s ,共42个循环。荧光素设置为FAM-490，在60 ℃时单点收集荧光信号。
1.6 统计学分析 HBV DNA定量结果取均值后转换为对数形式表示，各组间的差异显著性采用计量资料配对t检验。
2 结果
2.1 以肝素锂和EDTA-K2为抗凝剂进行对比实验 两种抗凝剂对HBV DNA的定量结果的对数值分别为5.115±1.437和5.182±1.408,差异无统计学意义（t=1.965, P>0.05）。
2.2 模拟不同浓度肝素抗凝标本实验结果 肝素对HBV DNA定量结果的影响与肝素浓度有关，血浆标本中肝素终浓度在62.5U/ml以下时，定量结果与对照组比较并无降低，但当肝素终浓度达到125U/ml时，结果降低了2个数量级，而当肝素终浓度达到250U/ml以上时，PCR反应完全被抑制，结果见表1。
表1 不同浓度肝素对HBV DNA 定量结果的影响（略）
2.3 模拟不同程度溶血标本实验结果 无论是血红蛋白浓度低至0.07g/L的轻微溶血（肉眼不易觉察）,还是血红蛋白浓度高达37.0g/L的严重溶血，其血浆标本的HBV DNA定量结果与对照组比较，均无明显的降低。结果见表2。
3 讨论
3.1 荧光PCR定量结果的准确性与核酸的提取技术及标本的状态密切相关，而血红蛋白和肝素作为Taq 酶强抑制剂，将直接影响到PCR定量结果的准确性。因此，病毒核酸的提取方法能否有效去除血红蛋白和肝素显得尤为重要。目前，应用于HBV DNA核酸提取的方法主要有：直接煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法、碱裂解法、蛋白酶K消化-酚-氯仿法和磁珠核酸提取法等。其中，直接煮沸裂解法和沉淀煮沸裂解法因操作简便、成本较低而得到广泛应用，但直接煮沸裂解法只是通过直接加入裂解液与血浆混合，经煮沸使病毒核酸从病毒颗粒中释放出来后，直接用于扩增，血浆中抑制PCR反应的物质并未得到有效的去除。李金明等［6］报道采用直接煮沸裂解法进行病毒核酸提取，即使血红蛋白浓度仅为5.89μg/L时（肉眼未见明显溶血），PCR反应已明显受到抑制。沉淀煮沸裂解法则是先通过将沉淀剂与病毒核酸结合，经高速离心沉淀后，吸弃上清，再加入裂解液，经煮沸裂解使病毒核酸释放出来，虽然该方法亦并非对核酸进行纯化萃取，但吸弃上清的步骤中已将绝大部分的血红蛋白去除，实验结果显示，即使当血浆标本中血红蛋白浓度高达37g/L(肉眼观察，严重溶血)时,PCR反应亦未受到抑制。而日常工作中因穿刺、离心或标本保存不当等原因而造成的标本溶血，多为轻微或中度溶血，此类标本若采用沉淀煮沸裂解法提取病毒核酸，对PCR定量结果无明显影响。
表2 不同浓度血红蛋白对HBV DNA 定量结果的影响（略）
3.2 鉴于肝素对Taq 酶具有强抑制的特性，许多专家学者及试剂厂家均要求用于HBV DNA定量检测的血标本不得使用肝素抗凝，而推荐使用EDTA-K2作为抗凝剂。但随着核酸提取方法的不断改进，肝素对PCR的影响也可有效的控制。陶志华等［7］认为肝素浓度低于100U/ml时，不影响HBV DNA的定量检测。本文使用EDTA-K2和肝素锂作抗凝剂进行对比实验，HBV的定量结果无显著性差异(t=1.965,P>0.05)；肝素对HBV DNA定量结果的影响与肝素浓度有关，当血浆标本中肝素终浓度在62.5U/ml以下时，定量结果与对照组比较并无降低，但当肝素终浓度达到125U/ml时， PCR反应明显受到抑制，结果降低了2个数量级，而当肝素终浓度达到250U/ml以上时，PCR反应完全被抑制。可见，由于该方法并非对病毒核酸进行纯化萃取，高浓度肝素仍可能残留而影响PCR扩增。但使用常规浓度肝素抗凝的血浆标本，仍可采用沉淀煮沸裂解法提取HBV DNA进行FQ-PCR定量检测。
【参考文献】
［1］ Rokuhara A, Tanaka E, Matsumoto A, et al. Clinical evaluation of a new enzyme immunoassay for hepatitis B virus core-relatedantigen; a marker distinct from viral DNA for minitoring lamivudine treatment［J］. J Viral Hepat, 2003, 10(4):324.
［2］ Ho SK, Yam WC, Leung, et al. Rapid quantification of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using fluorescent hybridization probes［J］. J Med Microbiol, 2003, 52(5):397.
［3］ Higuchi R. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In :Erlich HA, eds. PCR technology : principles and applications for DNA ampliofication［J］. New York : Stockton Press, 1989,31～38.
［4］ Akane A, Matsubara K, Nakamura H, et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid(DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction(PCR) amplification［J］. J Forensic Sci,1994,39(2):362～372.
［5］ 申子喻，李金明. 临床基因扩增检验技术［M］. 第1版. 北京：人民卫生出版,2002,66.
［6］ 李金明，王露楠，邓巍.标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响［J］.中华检验医学杂志， 2000，23（6）：337～339.
［7］ 陶志华,谢耀盛，周武，等. 不同标本对荧光实时定量PCR 法测定HBV-DNA结果的影响［J］.临床检验杂,2001，19（6）：345～346.
作者单位：江门市中心医院检验科,广东 江门 529030； 广东医学院2003级实习生,广东 湛江 524000