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【摘要】 目的 食物中毒的病原菌检测。 方法 分别采集当日食物中毒学生肛拭子45份,当日相关工作人员肛拭子55份,剩余食物共34份,当日砧板、刀等物表涂抹物5份,饮用水样品5份等,样品参照GB/T4789-2003、WS/T.9-1996、WS/T81-1996、GB17012-1997进行检测。 结果 45份学生肛拭子检出肠炎沙门菌14株,占31.11%,同时在剩余食物凉拌豆芽和海带检出肠炎沙门菌。 结论 此次食物中毒是由凉拌豆芽和海带引起的肠炎型沙门菌食物中毒。
【关键词】 食物中毒 肠炎沙门菌 鉴定
沙门菌属细菌种类繁多,其血清型超过2 000个,我国已发现216个,广泛分布于自然界中,是人畜共患的肠道病原菌。沙门菌也是引起细菌性食物中毒最常见的病原菌之一。2007年5月12日,本中心接到报告,称温州某大学在体检过程中发现部分学生有发热腹痛腹泻症状,即派人赶赴现场,协助卫生监督所采集样本。对采集的样品进行实验室检测,共检出肠炎沙门菌14株, 同时在剩余的凉拌豆芽和海带各检出1株肠炎沙门菌。根据流行病学调查和实验室检测分析,确认这起食物中毒是由肠炎沙门菌所引起。现将检测结果报告如下。
1 流行病学调查
2007年5月12日13时50分,温州市卫生监督所接瓯海区卫生监督所报告:温州某大学有20多名学生近日出现发热腹痛腹泻症状,怀疑是食物中毒。通过调查本次疾病暴发涉及人员均在C区食宿,共计84人到医院就诊,有腹泻、发热,体温38℃以上,并伴有腹痛等症状,所有出现症状的人员在48h后康复。
2 实验室检测
2.1 试剂和材料
2.1.1 沙门菌诊断血清,购于兰州生物制品研究所,有效期内使用。
2.1.2 培养基 均由杭州微生物试剂有限公司提供,按培养基商品说明书配制灭菌。ID32E试剂条由法国生物梅里埃公司提供。
2.1.3 仪器 ATBExpression自动细菌鉴定仪由法国生物梅里埃公司制造。
2.2 样品采集 肛拭子100份(其中学生肛拭子45份及相关工作人员肛拭子55份),分别放人5ml碱性胨水和5ml SS增菌液;同时用WS平板分离,剩余可疑食物34份,物品表面涂抹物5份,饮用水5份。
2.3 检验项目 根据食品卫生监督所要求检测:沙门菌、副溶血弧菌及变形杆菌。
2.4 检验方法 参照国家标准GB/T4789-2003[1],WS/T.9-1996[2],WS/T.81-1996[3]、GB17012- 1997[4]有关章节进行。
2.5 检验程序
2.5.1 可疑食物 ①直接分离接种TCBS平板、SS平板置36℃ 培养24h。②同时进行增菌→分离→挑取可疑菌落。进一步鉴定。
2.5.2 肛拭子 ① 碱性胨水置36℃培养8h分离于TCBS平板培养16h,挑取可疑菌落进一步鉴定。②SS增菌液置36℃培养18h分离于SS平板培养24h,挑取可疑菌落进一步鉴定。③ 刀、砧板的涂抹物加入到5ml碱性胨水和5ml SS增菌液按①、② 程序进行。
2.6 检测结果
2.6.1 29份剩余食物(12日中餐)及5份砧板、刀等物表涂抹物,5份饮用水均未检出目的菌。5份剩余食物(10日晚餐)检出肠炎沙门菌2株。
2.6.2 45份学生肛拭子检出肠炎沙门菌14株,占31.11%,相关工作人员肛拭子55份均未检出目的菌。
2.6.3 肠炎沙门菌的鉴定
2.6.3.1 挑取SS、WS平板可疑菌落进行涂片染色镜检为G-短杆菌,再接种到三糖铁培养基和营养琼脂平板做血清学鉴定和生化试验。
2.6.3.2 生化结果
2.6.3.2.1 生化反应 根据三糖铁-/+,H2S+初步生化结果,再做生化试验,结果见表1。
2.6.3.2.2 ATBExpression自动细菌鉴定仪鉴定 为提高准确度和检验速度,我们同时使用了ATB系统鉴定。挑取可疑接种于ID32E试剂条,按说明书进行操作,ATB生化谱结果为70760543020,极好鉴定结果,沙门菌属符合率为99.9%。其生化谱见表2。
表1 生化试验鉴定结果(略)
表2 ID 32 E V2.0 生化谱(略)
2.6.3.3 血清学鉴定 16株细菌均与沙门菌属诊断血清O多价(A-F)为(+ ++)、生理盐水阴性。“O”因子血清1凝集(+++) ,“O”因子血清9凝集(+++)、“H”因子血清第一相g、m凝集试验(++),经多次反复诱导均不出现第二相。推断得知这次分离菌株抗原结构式为1,9,12:g,m(59种沙门菌诊断血清缺“O”因子血清12)。根据考夫曼一怀特沙门菌属抗原表,符合肠炎沙门菌血清型。
2.6.4 直接分离与增菌后分离的比较 肛拭子直接分离与增菌后分离同时进行有利提高检出率 我们选用部分肛拭(编号为512-001~022共22份)直接分离WS和增菌后分离SS平板,检测结果见表3。
表3 16株肠炎沙门菌检出对比(略)
注:+为检出,-为未检出
3 讨论
3.1 小结 在45份病人肛拭标本及5份剩余食品凉拌豆芽和海带均检出沙门菌,共16株,检出率较高。经过分离培养、生化反应、血清学鉴定,结合《沙门菌属诊断抗原表》确定所分离的沙门菌为肠炎沙门菌(S.enteritidis,1,9,12:g,m。)。根据流行病学调查、病人的临床症状以及细菌学鉴定结果综合分析:病人肛拭、剩余食品(凉拌豆芽和海带)均检出生物性状一致的肠炎沙门菌,而未检出其它常见的致病菌;依据GB14938-1994[5]和WS/T.9-1996[2]WS/T.81-1996[3],本次食物中毒判定为由肠炎沙门菌感染所致。
3.2 沙门菌引起的食物中毒在我国广大内陆地区占首位。据文献报道,肠炎沙门菌感染从20世纪80年代后期起在欧美各国有形成大流行的迹象。沙门菌常能产生类似霍乱毒素样的沙门菌毒素。本次爆发以发热、腹泻、腹痛为主伴有头晕、头晕等肠道感染症状,发热现象较突出,腹泻多为黄水样便,个别病例诉有恶臭,中位潜伏期为17h,这些表现符合沙门菌导致的临床表现。通过进食史的分析,5种食品中仅C区一餐厅供应的豆芽和海带,提示与疾病暴发相关。9日和10日该餐厅晚餐和夜宵均有供应上述可疑食品,检测报告分别在豆芽和海带以及发病者肛拭样品检出同一型别沙门菌,为判断该起疾病暴发是一起沙门菌导致的食物中毒事件提供了强有力的依据。
3.3 沙门菌O抗原并非沙门菌属所特有。已知弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希菌的许多O抗原完全相同或部分相同。单用O多价血清凝集试验可导致误诊,误诊率可高达30%~70%,应采用单价因子血清凝集试验,并结合赖氨酸脱羧酶、氰化钾、pH7.2尿素酶、H2S、靛基质试验五项生化试验,或用噬菌体裂解试验,可以减少误诊率。
3.4 使用自动化鉴定仪的局限性 ATBExpression自动细菌鉴定仪鉴定可减轻手工操作的繁琐。通过自动化鉴定仪得出的结果,必须与其它已获得的生物性状(如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征)进行核对,以避免错误的鉴定。细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变,使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系,及时更新数据库。目前为止,自动化鉴定系统尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法,因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。
国内已有报道,DNA探针及PCR技术在沙门菌检测中的应用,但作为实验室常用操作规范,尚需在规范化及标准化方面作大量工作。我们应不断努力探索先进的检测方法,提高沙门菌检出率,尽可能杜绝其传染源,减少食物中毒的发生。
【参考文献】
[1] GB/T4789-2003.食品卫生微生物检验[S].
[2] WS/T.9-1996.副溶血弧菌食物中毒诊断标准及处理原则[S].
[3] WS/T.81-1996.变形杆菌食物中毒诊断标准及处理原则[S].
[4] GB17012-1997.感染性腹泻的诊断标准及处理原则[S].
[5] GB14938-1994.食物中毒诊断标准及技术处理总则[S].
作者单位:温州市疾病预防控制中心,浙江 温州 325000