HPLC法测定碳酸饮料中日落黄含量的不确定度分析

【摘要】  　　摘要：目的 对HPLC法测定碳酸饮料中日落黄含量的不确定度分析评估，以给出测定结果的不确定度。 方法 依据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》原理与方法，利用相关的数学模型对实验过程的不确定度因素进行分析，计算不确定度各分量，合成不确定度。 结果 测量重复性引起的不确定度为3.89%，取样引起的不确定度为0.025%，标准品引起的不确定度为0.58%，体积引起的不确定度为0.30%，标准曲线（线性回归）引起的不确定度为0.21%，饮料中日落黄含量的扩展不确定度为3.95%（包含因子K＝2）。 结论 从不确定度各分量计算结果可见，影响HPLC法测定碳酸饮料中日落黄的不确定度主要因素是测量重复性。

【关键词】  高效液相色谱法 碳酸饮料 日落黄 不确定度

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。通俗地解释，测量不确定度是指可疑程度或习惯地俗称为“不可靠程度”，它是测量结果可疑程度的一种定量表述，定量地说明了实验室测量能力水平［1］。在不确定度评估中，随着检测方法的不同，引入不确定度的分量也有所不同。我们根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》原理与方法［2］，通过对HPLC法测定碳酸饮料中日落黄含量的不确定度分析，找出影响不确定度的主要因素。

　　1  检测过程概述

　　1.1  标准样品  日落黄标准溶液（国家标准物资研究中心，GBW（E）100003a），浓度0.50mg/ml，不确定度：1%。

　　1.2  检测过程

　　1.2.1  色谱条件  色谱柱：XDB-C18  4.6mm×150mm×5μm  不锈钢柱；流动相：甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）；流速：1.0mL/min；进样量：5μl；检测器：二极管阵列检测器，波长： 254nm;梯度洗脱：甲醇：0～2min， 4%～20%;2～6min，20%～35%;6～10min，35%～50%；50%继续3min。

　　1.2.2  标准系列配制  用单标线吸管吸取适量日落黄标准溶液，用超纯水稀释至每毫升相当于5、10、25、50μg日落黄。

　　1.2.3  样品前处理  称取20.00g试样,依据国标GB/T 5009.35-2003规定方法［3］提取，定容至10ml。

　　1.2.4  分析  标准系列及样品液经0.45μm滤膜过滤后按1.2.1色谱条件测定，制得液相色谱图，以保留时间和峰面积与标准比较定性和定量（多点校正）。

　　1.3  数学模型
   
　　被测量xc0AxA0·Vm×1000=x'×Vm×1000，其中x'=A-ab
   
　　式中x—样品中所测物质的含量，g/kg；x'—进样液中所测物质的含量，μg/ml（根据Agilent 1100液相色谱仪化学工作站（LC 1100 ChemStation）中外标多点校正法）；V—样品稀释液体积，ml；m—取样量，g；c0—标准溶液浓度，μg/ml；Ax—样品溶液的峰面积；A0—标准溶液的峰面积。

　　1.4  不确定度传播律
   
　　u2r(x)=u2r(x')+u2r(V)+u2r(m)

　　1.5  不确定度来源  不确定度分量的来源：1、测量重复性；2、取样；3、标准品；4、体积；5、标准曲线（线性回归）。
   
　　x'引起的不确定度由标准溶液浓度及其峰面积、样品峰面积组成，而样品峰面积和标准峰面积的不确定度皆是由重复进样而引起的，所以把两者归结为重复性（rep）。因此，重复性包括：样品称重重复性（电子天平读数）、玻璃器皿（10mL单标线容量瓶）读数重复性、标准峰面积和样品峰面积重复性。

　　2  结果

　　2.1  重复性u1  用HPLC法测定样品3次，其测试结果见表1。则相对标准不确定度u1=sd/x= 3.89%。

　　表1  日落黄含量检测结果测定（略）

　　2.2  取样引起的不确定度u2  因为天平称量重复性并入到合成重复性中，这里不予考虑，而只考虑校正不确定度。称样质量m=20g，从天平校准证书查得校正不确定度u95=0.01g，k=2，则u(m)=0.01/2=0.005(g),u2=ur(m)=u(m)/m=0.005/20=0.00025=0.025%。

　　2.3  标准溶液的不确定度u3  标准物质证书上提供的不确定度为1%，按均匀分布处理，ur(c00)=1%/3=0.58%。

　　2.4  体积不确定度u4  样品、标准的配制所涉及到的玻璃容器体积和移液器体积的不确定度按均匀分布处理k=3，忽略温度的影响，则相对标准不确定度分别为：
   
　　uV1=0.02/(k×5.00)×100%=0.23%，uV2=0.025/(k×10)×100%=0.14%，
   
　　uV3=0.05/(k×25.00)×100%=0.12%，uV4=0.05/(k×50)×100%=0.06%，
   
　　uV5=0.02/(k×10.00)×100%=0.12%
   
　　则u4=0.30%

　　2.5  标准曲线引起的不确定度u5  用单标线吸管吸取适量日落黄标准溶液，用超纯水稀释成日落黄标准系列5、10、25、50μg/ml。

　　表2  标准系列测定的峰面积（略）

　　以日落黄含量c标为横坐标，峰面积A标为纵坐标绘制工作曲线，一元线性回归方程：y=6.98x+3.07，b=6.98，a=3.07，相关系数r=0.99996。
   
　　校准曲线的残差标准偏差S=∑ni=1(Ai-A⌒)2(n-2)=0.6124,Sxx=∑nj=1(cj-c)2=1225.00,n=4（测试校准溶液的次数）。测量样品3次，查工作曲线的结果分别为：36.08、34.15、37.41μg/ml，平均值为35.9μg/ml（即c0）。则校准曲线上得到的不确定度为：
   
　　u(c0)=Sb1P+1n+(c0-c)2Sxx=0.61246.98×13+14+(35.9-22.5)21225.00=0.075μg/ml(c为不同校准溶液的均值，b为斜率，c0为从标准曲线上查得的样品中日落黄的浓度均值，P为测试c0的次数）。因此
   
　　u5=u(c0)c0=0.075μg/ml35.9μg/ml=0.0021=0.21%

　　2.6  合成标准不确定度的评估  合并ur(x')［即ur(c)］、ur(V)、ur(m)和urep，得合成不确定度：
   
　　urelC(x)=u21+u22+u23+u24+u25=3.892+0.0252+0.582+0.302+0.212(%)=3.95%
   
　　uC(x)=x×uCr(x)=0.018×0.0395= 0.00071(μg/g)

　　2.7  扩展不确定度的评估  取k=2，扩展不确定度为Ur=k·uC(x)=0.002(μg/g)

　　2.8  不确定度的报告  碳酸饮料中日落黄的检测结果：W=（0.018±0.002）μg/g；（K=2）

　　3  讨论

　　3.1  根据HPLC法测定碳酸饮料中日落黄的不确定度分析结果，对测量不确定度影响最大的是测量重复性，其次是标准品、体积、标准曲线，取样引起的不确定度最小。分析测量重复性的不确定度主要来源于样品的制备过程，因此从提高取样的均匀性、定容的玻璃器皿精度、提高仪器设备的性能、保持操作过程的一致性，可以进一步减少测量结果的不确定度。

　　3.2  本例中日落黄含量的合成不确定度为3.95％，其中测量重复性不确定度贡献最大（3.89%），为最大分量，而其它不确定度各分量，如标准品、体积、标准曲线、取样各分量引起的不确定度均小于测量重复性不确定度的1/3，其结果在总不确定度计算中贡献很少，因此可以简化不确定度分量的计算，重点放在影响最大的主要分量上。

【参考文献】
  　　［1］ 李慎安. 商品检验不确定度评定释例［M］. 北京：中国计量出版社，2002,7.

　　［2］ JJF1059-1999. 测定不确定度评定与表示［S］.

　　［3］ GB/T5009.35-2003. 食品中人工合成色素的测定［S］.

作者单位：中山市疾病预防控制中心，广东 中山 528403