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【摘要】 摘要：目的 用HPLC法测齐墩果酸的含量。 方法 以齐墩果酸对照品作对照，采用HPLC法测定补肾调降丸中的齐墩果酸含量。色谱柱：ODS HYPERSIL C18 5μ( 4.6mm.I.D.×200mm)；检测波长：215nm；流动相：甲醇-水（84：16）;柱温：25℃；进样量：10μl，采用外标法。 结果 在优化色谱条件下，补肾调降丸中的齐墩果酸线性范围在1.0～40μg。回归方程为：Y=359.8524132X－2.148982, r=0.9999。含量测定的回收率为：97.72%, RSD=0.89%。 结论 所建立的方法专属性强，操作简便，结果准确，重现性好，适用于对补肾调降丸中的齐墩果酸含量的测定。
【关键词】 高效液相色谱法 齐墩果酸 补肾调降丸 含量测定
补肾调降丸为我地区医院中成药制剂大蜜丸，由熟地黄、知母、女贞子等十二味中药组成，具有滋阴降火、补益肝肾之功效。临床上用于阴虚火旺、消渴症、潮热盗汗、口干咽痛、头晕耳鸣、牙齿不固、小便短赤等症。
补肾调降丸原质量标准中无含量测定，该药处方中女贞子［1］为君药，其含齐墩果酸为主要成分，为控制内在质量，提高该药质量标准，我们对该药中齐墩果酸进行了含量测定的研究，本文采用HPLC法对补肾调降丸中的齐墩果酸含量进行测定，以便为该制剂质量提供简便、快速，结果准确、可行的含量测定方法，现报告如下。
1 仪器与试剂、试药
1.1 高效液相色谱仪 Agilent 1100 LC（包括G1379 serial# JP13209860 脱气机、G1311A serial# DE33223836四元泵、G1313A serial# DE3322926 自动进样器、G1316A serial# DE33234421柱温箱、G1315B serial# DE33219502 DAD检测器）;天 平：Sartorius Bp211D瑞士型电子天平;超声清洗器：JCX-400G（山东济宁超声电子仪器厂）。 紫外分光光度计：UV-2450型（日本岛津公司）
1.2 试剂 甲醇（美国Baker公司）色谱纯；三氯甲烷（北京化学试剂厂， 批号20050323）；甲醇（北京化学试剂厂， 批号20060523）均为分析纯；水为纯化水。
1.3 试药 样品 实验所用的中成药、阴性对照品来源均由吉林市中医院制剂室提供。补肾调降丸批号为：050808、050815、050824。齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110709-200304（含量测定用），规格：50mg/支。女贞子对照药材均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法和结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：（1）ODS HYPERSIL C18 200mm×4.6mm 5μ，（2）Shim-pack VP-ODS C18 150mm×4.6mm 5μ；流动相：甲醇-水（84：16）；柱 温：25℃ ； 流速：1.0ml/min ；检测波长：215nm；理论板数以齐墩果酸峰计算应不低于1000。
2.1.1 检测波长的确定 取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为齐墩果酸对照品溶液，用紫外分光光度仪在200～400nm范围进行光谱扫描，结果对照品溶液在213nm处有最大吸收。根据光谱扫描结果及参考有关齐墩果酸研究资料［2］，选用215nm作为本试验齐墩果酸含量测定的检测波长。结果见图1。
图1 齐墩果酸对照品紫外光谱图（略）
2.1.2 色谱条件 取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，滤膜滤过，即得，自动进样测定。结果无干扰，色谱条件符合要求。齐墩果酸对照品色谱图见图2。
2.1.3 系统适用性试验的考察 流动相的选择：参考文献［2］采用甲醇-水 （90 ：10）为流动相，经试验，调整甲醇-水（84：16）为流动相，分离效果好，保留时间适度，故确定其为本法的流动相。
理论板数(N)的确定（1）采用色谱柱 ODS HYPERSIL C18 200mm×4.6mm 5μ，流速：1.0ml/min ；在此条件下，供试品中齐墩果酸保留时间为15.1min, 理论板数以齐墩果酸峰计N=2235。（2）采用色谱柱 Shim-pack VP-ODS C18 150mm×4.6mm 5μ，流速：1.0ml/min，理论板数(N)大于1000时。分离度（R）≥1.5，结果见图，故理论板数以齐墩果酸峰计应不低于1000。依上述方法，测得齐墩果酸对照品溶液、供试品溶液的色谱图（见图2～3）。
图2 齐墩果酸对照品色谱图（略）
t=17.296,n=4503;Symm=0.79,R=10.57
图3 供试品色谱图（略）
t=17.574,n=4593; Symm=0.90,R=1.61
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含1mg的对照品溶液，作为齐墩果酸对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，剪碎，称取约18g（相当2丸重量），精密称定，加甲醇100ml，加热回流提取30min，滤过，残渣加甲醇同上，再重复回流提取2次，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解，转移至5ml容量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.3 阴性对照品溶液的制备 取阴性对照品（不含女贞子药材的样品）适量，精密称定，照供试品溶液同法操作制备的溶液，作为阴性对照溶液。
2.2.4 专属性实验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl注入液相色谱仪，按上述方法测定，结果表明,供试品溶液色谱中在与对照品相应的位置上有相同保留时间（齐墩果酸17.296）的色谱峰，阴性对照色谱图在与齐墩果酸相应的保留时间附近无干扰峰，证明本方法可行，见图2～4。
图4 阴性对照色谱图（略）
2.3 线性关系考察 取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成浓度为每ml含1mg的对照品溶液，摇匀，即得。分别精密吸取对照品溶液1μl、2μl、 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、40μl注入色谱仪中，记录峰面积，并以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准（关系）曲线（见图5）。结果见表1。
图5 齐墩果酸对照品标准曲线（略）
表1 标准曲线的实验结果（略）
计算得回归方程：Y=34.3775＋331.6158X r=0.99988。结果表明齐墩果酸在1.0μg～40μg范围内呈线性。
2.4 精密度试验 取同一样品（批号050808），按正文含量测定方法制得供试品溶液，重复进样5次，记录峰面积，实验结果见表2，RSD=0.73%。表明本方法所用仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验 取同一样品，按正文含量测定方法制得供试品溶液，分别于0、3、6、12、24、36h间隔进样测定，记录峰面积，以峰面积为指标，考察其稳定性，试验结果：RSD=1.32%，表明供试品溶液在36h内稳定。结果见表3。
2.6 重复性试验 取同一批样品，依法独立含量测定6次，试验结果见表4。 结果RSD=0.86%。表明本法重现性良好。
表2 精密度的试验结果（略）
表3 稳定性的试验结果（略）
表4 重复性试验结果（略）
2.7 回收率测定试验 采用加样回收测定法，取本品已知含量的样品（ 批号：050808、齐墩果酸含量为2.52mg/丸、平均丸重为9.12g）适量，剪碎，分别取6份（每份约9g），精密称定，每份各精密加入齐墩果酸对照品溶液2.5ml，混匀，按含量测定法制备供试品溶液，并依法测定含量，结果见表 5。
回收率%=测得的齐墩果酸的量－样品中齐墩果酸的量加入齐墩果酸对照品的量×100%
表5 齐墩果酸回收率试验结果（略）
结果表明,本法平均回收率为97.07% ，RSD为1.37%，表明本法准确度较好，方法可行。
2.8 样品含量测定 取本品3批，按上述方法制备供试品溶液及对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，依法测定，即得，按外标法计算含量（n=5），结果齐墩果酸含量见表6。
表6 齐墩果酸含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 通过上述3批样品中齐墩果酸的测定结果表明，本品最高含量为2.55mg/丸，最低含量为2.45mg/丸，其均值为2.50mg/丸。综合考虑确定限度每丸含女贞子以齐墩果酸（C30H48O3）计不得少于2.0mg。（考虑药材质量及生产工艺的波动，以其均值的80%为限，暂定本品含量限度）
3.2 测定波长的选择 我们对对照品溶液用紫外分光光度仪在200～400nm范围进行光谱扫描，结果对照品溶液在213nm处有最大吸收。根据光谱扫描结果及参考有关齐墩果酸研究资料，试验表明选用215nm作为本试验齐墩果酸含量测定的检测波长，测定结果适宜。
3.3 稳定性 本品甲醇溶液在常温48h内基本稳定。此外，样品甲醇溶液在实验过程中放置一周含量基本未发生变化。
3.4 本方法结果准确方法简便重现性及回收率均理想可以作为该制剂的质量控制方法。
【参考文献】
［1］ 中华人民共和国药政管理局.现代实用本草［M］.中册.北京:人民卫生出版社,2000,64.
［2］ 李琴韵,张雷.HPLC测定左归颗粒中熊果酸和齐墩果酸含量［J］.中国中药杂志,2005,30(4):308～309.
作者单位：北华大学附属医院,吉林 吉林 132001; 吉林鹿王药业,吉林 吉林 132001