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【摘要】 目的 建立消癥丸的微生物限度检查方法并进行验证,保证检验结果的正确性和可信性。 方法 采用平板菌落计数法对本品的细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证；采用常规法对大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌控制菌方法进行验证。 结果 通过5种阳性菌的回收率试验，以平板菌落计数法测定消癥丸大肠埃希菌、枯草芽孢杆 菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率皆在85%以上；控制菌测定中，大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌均可检出试验菌，阴性菌对照组均无生长。 结论 本文所确定的方法可作为消癥丸的微生物限度检查方法学验证的依据。
【关键词】 微生物限度检查法 消癥丸 方法学验证
消癥丸为三亚市中医院科研制剂,系委托海南省中医院制剂室加工配制而成的水丸。由柴胡、郁金、枳实、红花、浙贝母、丹参、川芎、鳖甲（醋）、穿山甲（炮）等十七味组成的中药复方制剂，具有疏肝理气，化瘀散结。用于乳腺增生，卵巢囊肿，子宫肌瘤，以及输卵管不通等症。临床使用疗效显著。该药为含有多味中药组成的复方制剂，化学成分复杂，在投料和加工过程中，或有抑菌成分存在，或由于各种成分相互作用的结果，可能对制剂的微生物限度检查产生影响，使其检查结果不准确，给临床使用带来隐患。因此，本实验对消癥丸的微生物限度检查及控制菌检查进行方法学验证，以建立其科学可靠的检查方法。
1 试验材料
1.1 药品 消癥丸 （海南三亚市中医院院内中药制剂，批号：070506）
1.2 菌种 大肠埃希菌CMCC（B）44102、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、白色念球菌CMCC（F）98001、黑曲霉CMCC（B）98003，均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 培养基 玫瑰红钠琼，批号：060223；营养琼脂，批号：060214；胆盐乳糖培养基，批号：060117，均由北京三药科技开发公司提供；MUG，批号：051207，由北京牛牛基因技术有限公司提供。
2 溶液制备
2.1 菌液制备 取经37℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1ml，加入9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至10-5，做活菌计数备用。取经25℃培养18～24h的白色念珠菌液体培养物1ml，加入9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至10-5，做活菌计数备用。取经25℃培养1wk的黑曲霉斜面培养物加3～5ml灭菌生理盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液1ml，加入9ml灭菌生理盐水10倍稀释至10-3，做活菌计数备用。
2.2 供试液制备 取本品10g溶于100ml的pH氯化钠-的蛋白胨缓冲溶液中，使分散均匀，静置约10min，取上清液作为1：10的供试液。
3 细菌、霉菌及酵母菌检查方法的研究［1］
3.1 试验组 按照平板菌落计数法，取3组平皿，每组2个，分别加入1ml（1：10）的供试液，各组分别加入1ml金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌液，分别倾注15ml营养琼脂平皿，于36℃培养，每天观察结果，计数；另组分别加入1ml白色念珠菌和黑曲霉菌液，分别倒入15ml玫瑰红钠琼脂培养基，于26℃培养，每天观察结果，计数，结果见表1。
表1 细菌、霉菌及酵母菌检查方法的研究结果（略）
3.2 菌液组 测定每一菌株的试验菌数，采用平板菌落计数法。
3.3 供试品对照组 不加菌液，其它操作同试验组，测量样品本底菌数，结果见表1。
回收率计算公式：
试验组回收率%=（试验组菌落数均值-供试品对照组菌落数均值）/菌液组菌落数均值×100%稀释剂对照组菌落数=稀释剂对照组均值/菌液组菌落数均值×100%
4 控制菌检查方法的研究［1］
4.1 大肠埃希菌 常规法：取本品10g溶于100ml的pH氯化钠的蛋白胨缓冲溶液中，使分散均匀，静置约10min，取上清液作为1：10的供试液。取上述1：10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖增菌液中，然后加入1ml大肠埃希菌液，置36±1℃温度培养24h观察结果。阴性菌对照组采用金黄色葡萄球菌。
4.2 大肠菌群 常规法： 取本品10g溶于100ml的pH氯化钠-蛋白胨缓冲溶液中，使分散均匀，静置约10min，取上清液作为供试液I（1：10）；再取供试液Ⅰ 1ml加至9ml生理盐水中混匀即为供试液Ⅱ（1：100）；最后取供试液Ⅱ 1ml加至9ml生理盐水中混匀即为供试液Ⅲ（1：1 000）。分别取供试液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1ml分别加入15ml胆盐乳糖发酵管中，然后分别加1ml大肠埃希菌液，置36±1℃温度培养24h观察结果。阴性菌对照组采用金黄色葡萄球菌。
4.3 沙门菌 常规法：取本品10g溶于250ml的营养肉汤中，使样品溶解分散后，加入1ml沙门菌液，置36±1℃温度培养24h观察结果。阴性菌对照组采用金黄色葡萄球菌。
4.4 控制菌检查结果 见表2。
表2 控制菌检查结果（略）
5 讨论
5.1根据《中国药典》2005年版一部规定，微生物限度检查中的细菌数、霉菌和酵母菌数计数方法验证的回收率应不低于70%，本文采用平板菌落计数法对消癥丸进行方法验证，结果回收率皆在85%以上，故用该方法能准确的进行微生物限度检查，确保结果的真实性和可信性。
5.2 消癥丸中因含有郁金、枳实、浙贝母、川芎等药材原粉，以及龟板（制）、鳖甲（醋）、穿山甲（炮）等动物类原药材粉。《中国药典》2005年版一部规定，控制菌检查须检验大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌。经方法验证试验，以上3种菌的检验均可采用常规法进行。
【参考文献】
［1］ 中国药典［M］.第一部，2005,502，附录71～73.
作者单位：三亚市中医院,海南 三亚 572000