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【关键词】 结核分枝杆菌 38KDa 血清学诊断
结核病严重危害人类的生命健康，在当今世界上每1秒钟就有1人新感染结核病，如不控制，今后10年，全球将有9 000万人发病。要想从根源上控制结核病的流行，诊断仍是所有措施中最为关键的一步。近年来报道较多的主要是血清学诊断技术，这项技术起始于19世纪末，是一种快速、简便的检查技术，主要是检测结核病人血清中的特异性抗体，在多种疾病的诊断中得到广泛的应用，寻找结核分枝杆菌特异性抗原是这项技术发展的关键，目前国内外研究人员主要采用基因工程的手段来获取单一特异抗原。38KDa蛋白是结核菌特异的分泌蛋白，缺乏抗38KDa抗体的血清很难与结核菌其它抗原发生反应［1］。海南医学院附属医院实验室通过已构建好的38KDa基因工程菌经过表达、纯化制备了38KDa蛋白抗原，并通过ELISA检测方法评价本室制备的38KDa蛋白的血清学诊断价值，为自主研发结核病免疫学诊断试剂确立抗原基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 编码结核分枝杆菌38KDa蛋白的基因工程菌BL21(DE3)/pET-30a-38kD由本室构建［2］，表达载体为PET30a ,宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
1.1.2 血清来源 54份肺结核患者血清由海口市结核病防治所提供，其中菌阳性患者血清14份，菌阴性患者血清40份；海南省农垦总局医院提供结核蛋白芯片检测38KDa抗体阳性血清8份，结核蛋白芯片检测38KDa抗体阴性血清5份，健康查体者血清96份。
1.1.3 试剂 Protein Marker购自北京经科宏达有限公司；IPTG、卡那霉素、Bio标记抗人球蛋白、碱性磷酸酶化亲和素、NBT/BCIP显色底物购自北京欣经科有限公司；尼龙膜购自Hybond公司；HRP标记抗人球蛋白和显色底物购自海南华美公司；脱脂奶粉购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司；6×His-tagged Ni-NTA Agarose蛋白纯化柱是QIAGEN公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 基因工程菌的诱导表达 将本实验室冻存的编码结核菌38KDa蛋白的基因工程菌复壮后，以2％的接种量加入2 000ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol／L，继续诱导4h，取少量菌液进行SDS-PAGE诱导表达鉴定，考马斯亮蓝R-250染色。
1.2.2 包涵体收集与初步纯化 5 000rpm，15min收集诱导后的菌体，将菌体沉淀以30ml/mg重悬于细胞超声波破碎缓冲液（50mmol/L TRIS·HCl pH8.0；1mmol/L EDTA；50mmol/L NaCl；5％甘油），冰浴条件下进行超声波破碎，12 000rpm，4℃离心15min，收集沉淀；用包涵体洗涤缓冲液(50mmol/L TRIS·HCl pH8.0；2mmol/L尿素；0.5％Triton-X-100)洗涤3次，获得的沉淀即为纯化的包涵体。
1.2.3 38KDa蛋白亲和层析纯化与复性 将带6-His标签的包涵体在含8M尿素的包涵体变性缓冲液中溶解，室温放置3h后经Ni柱纯化，收集洗脱峰。将纯化后的包涵体变性液装入透析袋中进行复性，复性条件变化不应太过剧烈，以免形成絮状蛋白沉淀，通常每隔6h更换一次复性液（2mmol/L还原型谷胱甘肽；0.2mmol/L 氧化型谷胱甘肽），复性48h,收集复性后的蛋白溶液经紫外吸收法测定浓度后，-20℃冻存。
1.2.4 斑点免疫结合法（Dot-immunobinding assay）鉴定38KDa蛋白特异性 将38KDa蛋白点样于尼龙膜上，吸附后加入封闭液，37℃，1.5h。倾去封闭液，洗膜三次，每次5min，分别与结核患者血清和正常对照血清反应，37℃孵育1h；洗膜后加入生物素标记羊抗人IgG，37℃孵育1h；加入碱性磷酸酶缓冲液洗膜5min，弃去缓冲液，加入碱性磷酸酶化亲和素与生物素作用，37℃，1h；添加NBT/BCIP显色液避光显色15min。
1.2.5 建立38KDa复性蛋白ELISA检测方法并评价其免疫反应性 通过方阵法确定38KDa复性蛋白最佳抗原包被浓度，先将蛋白稀释成不同浓度与结核患者血清和正常对照血清反应，再与不同稀释度HRP标记的二抗反应，得出抗原和HRP标记二抗的最适工作浓度。检测结核患者血清和正常对照血清中的抗结核抗体，以阴性对照血清OD450值的2.1倍判定为阳性值，计算敏感性与特异性值，并进行χ2统计分析。
2 结果
2.1 38KDa蛋白诱导表达结果 工程菌经诱导后，进行SDS-PAGE分析，约在38KDa处出现目的蛋白条带，相对分子质量与预计相符，而未诱导的菌体没有明显的条带，见图1。利用BandScan软件进行光密度分析发现目的蛋白表达量占总蛋白的22.80%。
图1 工程菌诱导表达SDS-PAGE分析（略）
Fig 1 Expression of the 38KDa gene in E.coli BL21(DE3) analyzed by SDS-PAGE
M：Protein Molecular Weight marker; 1：Induced by 1mmol/L IPTG for 4h; 2：Control without induction
2.2 包涵体收集与初步纯化 将菌体沉淀经超声波破碎后收集上清和沉淀部分，通过SDS-PAGE分析可以看到目的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中，经包涵体洗涤缓冲液洗涤后即为初步纯化后的包涵体，见图2。
图2 包涵体收集及初步纯化（略）
Fig 2 Collection of inclusion bodies and initial purification
M: Protein Molecular Weight marker; 1: Supernatant fluid; 2:Inclusion bodies; 3: Washed pellets
2.3 包涵体的纯化与复性 包涵体纯化复性后经SDS－PAGE电泳只出现1条目的蛋白条带，纯化效果较好，测定其蛋白浓度为0.295mg/ml，见图3。
图3 重组38KDa蛋白纯化结果（略）
Fig 3 Purification of recombinant protein
M: Protein Molecular Weight marker; 1: 38KDa protein purified by Ni-NTA affinity chromato- graphy
2.4 DIBA鉴定重组38KDa复性蛋白 通过DIBA法显色结果可以判定重组38KDa蛋白与结核患者血清抗体特异性结合,而与正常对照血清则无反应(图4)。
图4 DIBA鉴定38KDa复性蛋白反应结果（略）
Fig 4 DIBA showing reaction results
A. Positive reactivity of sera from TB patients; B. negative reactivity of sera from Controls
2.5 基于38KDa蛋白的ELISA检测方法的初步建立及评价 通过方阵法得到38KDa复性蛋白抗原最适包被浓度为0.1μg/ml，酶标二抗最适工作浓度为1:1000。ELISA检测肺结核患者血清结果见表1。其中痰涂阳性患者、痰涂阴性患者敏感性分别为64.29%、62.50%。痰涂阳性患者敏感性略高于涂阴性患者，但两者之间差异无统计学意义（χ2=0.02,P>0.05）,总敏感性为62.96%。检测正常对照血清96份，假阳性率为15.63%,特异性为84.38%。
表1 ELISA检测结核患者的阳性率比较（略）
Table 1 TB antibody positive rates of pulmonary tuberculosis patients
2.6 结核蛋白芯片系统和ELISA同时检测结核患者和阴性对照者血清结果 通过包被38KDa蛋白抗原进行ELISA检测13份血清标本结果见表2，发现与结核蛋白芯片抗38kDa抗原强阳性的患者血清和芯片检测阴性血清的结果一致，抗体检测结果的符合率为100％。
表2 结核芯片系统和ELISA检测结核病人和对照者的38KDa抗体阳性率比较（略）
Table 2 TB antibody positive rates determined by Tb protein chip system and ELISA
3 讨论
结核病的诊断，尤其是在早期因为临床症状不典型，常规的诊断方法如细菌培养和痰涂片镜检敏感性低，特异性差，耗时长，使得难以快速诊断早期疑似结核病人，错过了治疗的最佳时期。因此，建立早期诊断结核分枝杆菌感染的方法日益重要。血清学诊断可以根据机体感染结核菌后出现的各种免疫反应，通过检测患者血清中特异性抗体水平，使得早期诊断结核病成为可能，而这一技术的关键就在于获得结核菌特异的免疫优势抗原。早期研究人员主要从结核菌培养滤液种分离纯化各种抗原进行研究［3,4］，但这种方法不仅操作繁琐，而且得率不高。采用基因工程的方法获取单一特异抗原正逐渐取代早期的抗原分离手段。
国内外深入研究的特异性结核菌抗原主要是主要集中在一些可诱导机体产生明显免疫应答而且大部分是结核菌特异的分泌蛋白上，38KDa蛋白就是其中之一。38KDa蛋白是结核菌糖基化的类脂蛋白质,属于结核菌的膜蛋白,也称蛋白抗原b,是磷酸盐转运蛋白，只在结核菌复合体中表达,BCG合成38KDa蛋白的量仅为结核菌的1/10。该抗原可以诱导机体产生较强烈的体液和细胞免疫，缺乏抗38KDa抗体的血清很难与结核菌其它抗原发生反应。
1992年，Singh等［5］用表达载体pJLA603、启动子λPLPR高效表达非融合重组38KDa蛋白，表达量为菌体总蛋白的10％；1997年Wilkinson等［6］对重组38KDa抗原与结核菌本身合成的抗原在免疫学活性上是否存在差异进行了系统深入研究，结果发现重组38KDa抗原与本身合成的38KDa抗原无免疫活性差异，可以作为诊断试剂。2006年苏明权等［7］将38KDa基因克隆于pGEx-4T-2表达载体，转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，表达量约为18％。本实验室构建的基因工程菌38KDa表达量占总蛋白的22.80%,略高于文献的报道，表达蛋白以包涵体形式存在，羧基端带有6个组氨酸标签，易于纯化得到目的蛋白。
通过斑点免疫结合法发现38KDa复性蛋白被结核患者血清特异识别，进一步用ELISA的方法检测38KDa抗原复性蛋白敏感性为62.96%,其中检测痰涂阳性患者的敏感性略高于痰涂阴性患者的敏感性,分别为64.29%、62.50%，但两者之间无显著性差异(χ2=0.02,P>0.05)。此外,检测38KDa抗原特异性为84.38%，与国外一些研究结果相近［8,9］。尽管该抗原敏感性和特异性不是十分理想，但仍具有一定的血清学诊断价值，有助于结核病诊断试剂的开发。该蛋白除可以作为常规免疫诊断试剂的候选抗原，还可应用于结核蛋白芯片［10］，由于目前国内使用的结核蛋白芯片系统所使用的蛋白抗原多为进口的重组蛋白，如南京大渊生物技术工程责任公司开发的大渊蛋白芯片检测系统采用的38KDa蛋白由美国Fitzgerald公司生产，通过与该公司结核蛋白芯片检测结果进行比较，发现本室自制的重组38KDa蛋白免疫活性与国外进口的蛋白免疫活性相当，抗体检测结果的符合率100％，结果表明本室自制的重组38KDa蛋白可以取代进口产品，这将有利于我们降低试剂开发成本，减少结核患者检测费用，从而更好的开展结核病的预防工作。当然，如此高的符合率可能与我们所选标本例数较少有关，但同样可以说明本室自制的38KDa蛋白抗原有较好的免疫反应性，拥有良好的应用前景。
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作者单位：海南医学院附属新华医院,海南 海口 570311; 海口市结核病防治所,海南 海口 570208