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【摘要】 目的 探讨氧化苦参碱对人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。 方法 培养人表皮黑素细胞并及人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系，利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定细胞活力，采用酶学方法测定酪氨酸酶活性，475nm比色法测定黑素含量。 结果 100μmol/L、500μmol/L和1 000μmol/L氧化苦参碱对于黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性抑制作用，500μmol/L及1 000μmol/L氧化苦参碱与对照组相比有显著差异（P<0.01）。 结论 氧化苦参碱对于共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成有较强的剂量相关性抑制作用。
【关键词】 氧化苦参碱 黑素细胞 角质形成细胞 共培养
人肤色深浅主要由表皮中黑素细胞合成的黑素决定，黑素细胞合成黑素这一过程受到表皮中角质形成细胞以及其它一些细胞的影响，传统的针对影响黑素合成的药物研究大多在单独培养的黑素细胞中进行，然而，表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系相比单独黑素细胞更接近于人体，在这一体系中研究药物对黑素合成的影响更能显示药物的真实作用。氧化苦参碱一种单体，我们早期实验结果表明它可以剂量依赖的抑制蘑菇酪氨酸酶活性，本实验进一步研究其在人表皮黑素细胞及角质形成细胞和黑素细胞共培养体系中对于黑素合成过程的作用，此方面研究未见报道。
1 材料和方法
1.1 材料 氧化苦参碱购自中国药品生物制品检定所，纯度>99％；氢醌、中性酶、胰酶、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、1％抗生素/抗真菌溶液、1μg/ml转移因子、1μg/ml维生素E、5μg/ml胰岛素、0.6ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、10－8mol/L α－MSH、10－9mol/L ET-1购自Sigma公司，M154基础培养基、角质形成细胞生长添加物购自Cascade Biologicals，胎牛血清购自杭州四季青公司。
1.2 实验方法
1.2.1 取材来源 正常人黑素细胞与角质形成细胞均来源于12 ～18岁正常中国男性常规包皮环切术后的包皮（南京市第一医院泌尿科提供）。
1.2.2 黑素细胞培养 参照夏隆庆等方法进行［1］。
1.2.3 人表皮黑素细胞和角质形成细胞共培养体系的建立 参见我们已报道文献［2］。
1.2.4 MTT实验 将黑素细胞及共培养细胞按1×104/孔接种于96孔板，在37℃及5%CO2下孵育24h，去上清液，每孔加入含一定药物浓度的共培养培养基200μl，氧化苦参碱设6个浓度（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、400μmol/L、1 000μmol/L），每一浓度设4个复孔，对照组直接加共培养培养基200μl，空白孔不加细胞，只加培养基，继续孵育72h，每孔加入5g/L的MTT溶液20μl，在37℃及5%CO2下孵育4h，弃上清液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min，在酶标仪490nm波长（参考波长620nm）下测量各孔吸光度值，细胞增殖率＝［（待筛物各浓度平均吸光度值－空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值－空白组平均吸光度值）］ ×100％。
1.2.5 酪氨酸酶活性测定实验［3］ 将黑素细胞及共培养细胞按1×104/孔接种于96孔板，在37℃及5%CO2下孵育24h，去上清液，每孔加入含不同浓度药物培养基100μl，对照组只加培养基，空白组不加细胞，2μmol/L氢醌组作为阳性对照，每组重复3次，根据MTT实验结果选取3个浓度（100μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L），每隔1d换一次培养基，继续孵育6d后用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗1次，然后每孔加入0.5% Triton-X溶液100μl，超声振荡30min后，每孔加入10mM/L左旋多巴溶液50μl，于37℃下3h，在酶标仪490nm波长（参考波长620nm）下测量各孔吸光度值，酪氨酸酶活性影响率＝［（待筛物组平均吸光度－空白组平均吸光度）/（对照组平均吸光度－空白组平均吸光度）］×100％。
1.2.6 黑素含量测定实验［4］ 将黑素细胞及共培养细胞接种于60mm直径的培养皿中，在37℃及5%CO2下孵育24h，去上清液，分别加入含不同浓度药物的培养基，对照组只加培养基，2μmol/L氢醌组作为阳性对照，每组重复3次，氧化苦参碱根据MTT实验结果选取3个浓度（100μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L），每隔1d换一次培养基，继续孵育7d后用0.25%胰酶消化收获细胞，PBS洗2次，每组分别计数细胞，分别加入0.2ml双蒸水使细胞悬浮1min，然后加入500μl乙醇和500μl乙醚的混合物室温下放置15min，置离心机中以3 000转/min离心5min，去上清液，沉淀中加入1mol/L NaOH（含10％DMSO）1ml，于80℃下30min，加入4ml的双蒸水将NaOH稀释成0.2mol/L，分光光度计下测量475nm（参比波长620nm）的吸光度，黑素含量＝［（待筛物组吸光度/细胞数的平均值）/（对照组吸光度/细胞数的平均值）］×100％，重复4次。
1.3 数据处理 采用SPSS12.0软件t检验分析，数据以x±s表示。
2 结果
2.1 对细胞活力的影响 MTT实验结果显示氧化苦参碱浓度在（0.1～1 000μmol/L）对B16F10细胞、人表皮黑素细胞、角质形成细胞以及共培养细胞增殖都无影响。
2.2 对黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性的影响 结果表明（表1），氧化苦参碱对于黑素细胞及共培养体系中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性抑制作用，氧化苦参碱组与对照组比较均有统计学差异（P<0.05），500μmol/L及1 000μmol/L氧化苦参碱对黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性均有显著差异（P<0.01），氧化苦参碱对于黑素细胞中酪氨酸酶活性的抑制与对共培养细胞中酪氨酸酶活性抑制无差别（P>0.05）。
表1 氧化苦参碱对黑素细胞及共培养细胞中酪氨酸酶活性影响（略）
注:对照组相应值设为100％，与对照组相比，＃P<0.05，＃＃P<0.01。
2.3 氧化苦参碱对黑素细胞及共培养细胞黑素含量的影响 结果表明（表2），氧化苦参碱对于黑素细胞及共培养体系中黑素合成呈剂量依赖性抑制作用，氧化苦参碱组与对照组比较均有统计学差异（P<0.05），500μmol/L及1000μmol/L氧化苦参碱对黑素细胞及共培养细胞黑素合成均有有显著差异（P<0.01），氧化苦参碱对于黑素细胞中黑素合成的抑制与对共培养细胞中黑素合成抑制无差别（P>0.05）。
表2 氧化苦参碱对黑素细胞及共培养细胞中黑素合成影响（略）
注:对照组相应值设为100％，与对照组相比，＃P<0.05，＃＃P<0.01。
3 讨论
原代黑素细胞以及一些黑素瘤细胞常被用来检测黑素生成以及酪氨酸酶活性的变化，在此基础上筛选出的许多药物已经上市，一些药物（如氢醌）临床上获得了很好的疗效，但是很多筛出的药物实际应用中不能达到满意结果，近来，黑素细胞与角质形成细胞共培养技术逐渐成熟，这种共培养体系相比黑素细胞和黑素瘤细胞更接近于人体生理黑素生成过程。有研究发现一些药物对于共培养体系中黑素生成以及酪氨酸酶活性影响与其对单独黑素细胞中黑素生成以及酪氨酸酶活性影响具有明显差别［5］。
本实验在人表皮黑素细胞以及黑素细胞与角质形成细胞共培养体系中检测了氧化苦参碱对于黑素生成以及酪氨酸酶活性的作用，结果表明氧化苦参碱在不影响黑素细胞及共培养细胞活力的浓度（100μmol/L、500μmol/L及1 000μmol/L）下对于黑素细胞及共培养细胞中黑素生成以及酪氨酸酶活性均呈剂量依赖性抑制作用，氧化苦参碱对于黑素细胞中黑素生成及酪氨酸酶活性的抑制作用与其对于共培养细胞中黑素生成及酪氨酸酶活性的抑制作用无差别（P>0.05），氢醌作用与之相反，在共培养细胞中作用更强，这可能与不同物质对于角质形成细胞作用不同有关，因为在共培养体系中，待测物不仅仅直接作用于黑素细胞，还通过作用于角质形成细胞间接影响黑素细胞产生最终作用结果。本研究结果显示氧化苦参碱抑制黑素合成作用与其抑制酪氨酸酶活性呈正相关，提示氧化苦参碱抑制黑素合成作用主要与其抑制酪氨酸酶活性有关。氧化苦参碱在治疗色素过度沉着以及美白美容方面具有一定的开发应用前景。
【参考文献】
［1］ 夏隆庆，Zouboulis Ch，Karasagakis K,等.人体黑素细胞培养技术［J］.中华皮肤科杂志，1991,24(2):120～121.
［2］ 解士海，卜今，陈志强,等.在人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型中观察黑素小体的转运［J］.临床皮肤科杂志，2006,35(5):11～13.
［3］ Kazuhisa S,Takahisa N,Koji S,et al. Inhibitory Effects of α-Arbutin on Melanin Synthesis in Cultured Human Melanoma Cells and a Three-Dimensional Human Model［J］.Biol. Pharm. Bul.,2004,27(4):510～514.
［4］ Mun YJ, Lee SW, Jeong HW,et al. Inhibitory effect of miconazole on melanogenesis［J］. Biol. Pharm. Bul.,2004,27(6):806～809.
［5］ Lei TC，Virador VM,Vieira WD,et al.A melanocyte-keratinocyte coculture model to assess regulators of pigmentation in vitro［J］.Analytical Biochemistry,2002,305:260～268.
作者单位：惠州市皮肤病防治研究所，广东 惠州 516001; 中国协和医科大学、中国医学科学院皮肤病研究所，江苏 南京 210042