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【摘要】 目的 探讨双花对人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。 方法 采用MTT法测定双花对人A375黑素瘤细胞活力的影响，以NaOH裂解法测定黑素合成,并与氢醌的结果进行比较。 结果 100μmol/L、500μmol/L和1 000μmol/L双花对人A375黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性抑制作用，500μmol/L及1 000μmol/L双花与对照组相比有显著差异（P<0.01）。 结论 双花对于共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成有较强的剂量相关性抑制作用。
【关键词】 双花 黑素细胞 酪氨酸酶
色素障碍性疾病是临床上常见的皮肤病之一，目前对色素性疾病的机理还不十分清楚，人体皮肤颜色各不相同，与种族、年龄、性别、外界环境以及某些疾病等因素密切相关，其中黑素细胞产生的黑素是决定皮肤颜色的主要因素。双花是一种中药单体，傅国强等研究认为其在细胞外对酪氨酸酶有较强的抑制作用［1］。本研究研究双花对于人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 双花购自中国药品生物制品检定所，纯度>99％；氢醌、中性酶、胰酶、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自Sigma公司;小牛血清(杭州四季青公司)；高通量多功能微板测试系统（德国BMG），图像信号采集与分析系统（德国LEICA公司），倒置显微镜，无菌工作台等。
1.2 方法
1.2.1 人A375黑素瘤细胞株 人A375黑素瘤细胞株购自中国医学科学院基础所细胞中心。细胞以1×106个/ml密度在37℃，5% CO2孵箱中进行培养传代，细胞增殖良好至80%左右融合时进行实验。
1.2.2 双花对人A375黑素瘤细胞增殖的影响 MTT法选择对数生长期细胞，将人A375黑素瘤细胞按1×104/孔接种于96孔板，在37℃及5%CO2下孵育24h，去上清液，每孔加入含一定药物浓度的培养基200μl，双花设6个浓度（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、400μmol/L、1 000μmol/L），每一浓度设4个复孔，对照组直接加培养基200μl，空白孔不加细胞，只加培养基，继续孵育72h，每孔加入5g/L的MTT溶液20μl，在37℃及5%CO2下孵育4h，弃上清液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min，在酶标仪490nm波长（参考波长620nm）下测量各孔吸光度值，细胞增殖率＝［（待筛物各浓度平均吸光度值－空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值－空白组平均吸光度值）］×100％。
1.2.3 酪氨酸酶活性测定实验［2］ 将人A375黑素瘤细胞按1×104/孔接种于96孔板，在37℃及5%CO2下孵育24h，去上清液，每孔加入含不同浓度药物培养基100μl，对照组只加培养基，空白组不加细胞，2μmol/L氢醌组作为阳性对照，每组重复3次，根据MTT实验结果选取3个浓度（100μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L），每隔1d换1次培养基，继续孵育6d后用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗1次，然后每孔加入0.5%Triton-X溶液100μl，超声振荡30min后，每孔加入10mM/L左旋多巴溶液50μl，于37℃下3h，在酶标仪490nm波长（参考波长620nm）下测量各孔吸光度值，酪氨酸酶活性影响率＝［（待筛物组平均吸光度－空白组平均吸光度）/（对照组平均吸光度－空白组平均吸光度）］×100％。
1.2.4 黑素含量的测定［3］ 将人A375黑素瘤细胞接种于60mm直径的培养皿中，在37℃及5%CO2下孵育24h，去上清液，分别加入含不同浓度药物的培养基，对照组只加培养基，2μmol/L氢醌组作为阳性对照，每组重复3次，双花根据MTT实验结果选取3个浓度（100μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L），每隔1d换1次培养基，继续孵育7d后用0.25%胰酶消化收获细胞，PBS洗2次，每组分别计数细胞，分别加入0.2ml双蒸水使细胞悬浮1min，然后加入500μl乙醇和500μl乙醚的混合物室温下放置15min，置离心机中以3 000转/min离心5min，去上清液，沉淀中加入1mol/L NaOH（含10％DMSO）1ml，于80℃下30min，加入4ml的双蒸水将NaOH稀释成0.2mol/L，分光光度计下测量475nm（参比波长620nm）的吸光度，黑素含量＝［（待筛物组吸光度/细胞数的平均值）/（对照组吸光度/细胞数的平均值）］×100％，重复4次。
1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS统计软件进行两因素方差分析检验。
2 结果
2.1 双花对细胞活力的影响 MTT实验结果显示双花浓度在（0.1～1 000μmol/L）对人A375黑素瘤细胞增殖无影响(P>0.05),见表1。
2.2 双花对人A375黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响 结果表明（表2），双花对于人A375黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性抑制作用，双花组与阳性对照组比较，100μmol/L、500μmol/L及1 000μmol/L双花对人A375黑素瘤细胞酪氨酸酶活性抑制均有显著差异（P<0.01），1 000μmol/L双花作用优于氢醌。
表1 双花对A375黑素瘤细胞增殖的影响（略）
2.3 双花对人A375黑素瘤细胞黑素含量的影响 结果表明（表2），双花对于人A375黑素瘤细胞中黑素合成呈剂量依赖性抑制作用，双花组与阳性对照组比较，100μmol/L双花对于人A375黑素瘤细胞中黑素合成抑制作用有统计学差异（P<0.05），500μmol/L及1 000μmol/L双花对人A375黑素瘤细胞黑素合成抑制均有有显著差异（P<0.01）。1 000μmol/L双花作用与氢醌类似。
表2 双花对酪氨酸酶活性以及黑素含量的影响（略）
3 讨论
色素性皮肤病历来是难治的一类皮肤病，我国天然药物资源丰富，大量天然药物已经在历史记载中具有调节色素沉着的作用，其中很多已经广泛应用于临床实践中，国内外已经对其中很多单体进行了体外细胞外黑素合成及酪氨酸酶活性的影响，筛选出许多潜在的可能影响细胞内黑素生成的单体，傅国强等研究发现双花在细胞外可以很好的剂量相关的抑制黑素合成。
一些黑素瘤细胞常被用来检测黑素生成以及酪氨酸酶活性的变化，在此基础上筛选出的许多药物已经上市，一些药物（如氢醌）临床上获得了很好的疗效，因此本研究利用人黑素瘤细胞株A375研究双花对于细胞内黑素生成的影响，发现其可在不杀伤细胞的浓度范围内剂量依赖的抑制黑素生成，提示双花在治疗色素过渡沉着性皮肤病上具有一定的开发前景。
【参考文献】
［1］ 傅国强，马鹏程，吴勤学,等. 196味中药乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用［J］. 中华皮肤科杂志，2003,36(2):103～106.
［2］ Kazuhisa S,Takahisa N,Koji S,et al. Inhibitory Effects of α-Arbutin on Melanin Synthesis in Cultured Human Melanoma Cells and a Three-Dimensional Human Model［J］.Biol. Pharm. Bul.,2004,27(4):510～514.
［3］ Mun YJ, Lee SW, Jeong HW,et al. Inhibitory effect of miconazole on melanogenesis［J］. Biol. Pharm. Bul.,2004,27(6):806～809.
［4］ 范卫新，张美华，夏明玉,等. 甘草酸，熊果苷及氢醌对小鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的比较研究［J］. 临床皮肤科杂志，2000，29（2）：34～37.
作者单位：深圳市第九人民医院,广东 深圳 518000