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【摘要】 目的 制备一种新的抗蝰蛇毒卵黄抗体，并研究其免疫特性。 方法 将产卵母鸡分为低剂量（A组）和高剂量（B组）免疫组。以甲醛减毒法制备的蝰蛇毒抗原免疫母鸡；以水稀释法联合硫酸铵沉淀和超滤法分离纯化卵黄抗体；总蛋白质通过改良Lowry法测定;以ELISA法测定卵黄抗体的效价、总卵黄抗体与特异抗体含量、交叉反应。 结果 低、高剂量组均诱导母鸡产生有效免疫应答。高剂量组免疫效价高于低剂量组（P<0.05），高剂量组于免疫后约40d抗体效价达高峰,持续约4周；而低剂量组在免疫后约50d抗体效价达高峰，持续约2周。免疫过程中，两组总卵黄蛋白无显差异(P>0.05),但高剂量组卵黄中平均特异性抗体（0.29±0.04)mg/ml明显高于低剂量组（0.21±0.03)mg/ml（P<0.05）.制备的抗蝰蛇毒IgY与蝰蛇毒抗原具有较高特异性，但与五步蛇（54.3%）、蝮蛇(47.5%)及竹叶青蛇(43.1%)有明显交叉反应，与眼镜蛇（11.7%）有轻度的交叉反应。 结论 研究证实蝰毒抗原易诱导母鸡产生良好的免疫应答，并成功制备了抗蝰蛇毒的卵黄抗体，为蛇伤防治提供新的途径。
【关键词】 蝰蛇 卵黄抗体（IgY） 鸡 免疫特性 酶联免疫吸附测定(ELISA)
抗蛇毒血清主要由蛇毒免疫马匹而制得的特异性抗体,在体内能中和蛇毒,因而成为蛇伤治疗中的特效药物。然而，目前临床上使用的抗蛇毒马血清存在分离纯化过程复杂、流通不方便、相对分子质量大、价格昂贵，特别是有一定的过敏反应等缺点,从而限制了抗蛇毒血清临床应用［1］。因此，新的蛇伤治疗药物的开发和研究有着重要意义。
20世纪60年代,科学家研究发现,母鸡经抗原免疫刺激后,在输卵管内卵黄成熟期,血液中IgG被选择性地转移至卵黄中,是卵黄中惟一免疫球蛋白类，也称卵黄抗体或IgY(Immunoglobulin yolk)。研究表明，特异性IgY可应用于某些病毒、细菌和真菌所致疾病的诊断和防治。近年来,国外报道用蛇毒作为抗原免疫母鸡,从卵黄中提取特异的抗蛇毒卵黄抗体，在前期工作中，我们也初步研制了抗眼镜王蛇毒卵黄抗体［2,3］。本研究我们以减毒蝰蛇毒抗原免疫莱航母鸡，观察免疫后卵黄中卵黄抗体产生的动态规律，然后利用水稀释法联合硫酸铵沉淀和超滤法分离制备抗蝰蛇毒卵黄抗体，并对其免疫特异性进行研究，为新型抗蝰蛇毒抗体的开发提供有效依据。
1 材料与方法
1.1 材料 蝰蛇毒、饭匙倩、蝮蛇、百步蛇及眼镜蛇毒抗原由广州医学院药物中心余清声教授惠赠。蝰蛇毒按文献［4］采用甲醛脱毒法进行减毒；福氏佐剂(Freund’s adjuvant )为sigma公司产品; 四甲基联苯胺（TMB）购自广州博特生物公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鸡IgG(HRP-Goat Anti-chicken IgG)购自广州晶美公司公司； SM-3型自动酶标仪（北京圣健东方医疗仪器厂）；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 母鸡免疫 8只健康产卵莱杭母鸡（20～22周龄，购自广州力康公司），单笼饲养，环境温度控制在(20±2)℃,相对湿度为55%～60%，噪声低于50dB，光照时间12～16h，光照强度16lx，普通饲养喂养。免疫部位、方法及方案按我们以前的方法略作修改进行［3］。将制备的蝰蛇毒抗原液与等体积完全福氏佐剂充分乳化后，经鸡双翼 、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射。分低剂量（A组）和高剂组（B组）分别进行免疫：基础免疫剂量A组为0.2mg/只，B组0.4mg/只；基础免疫后的15d、30d后改为不完全福氏佐剂进行2次加强免疫，A组加强免疫剂量分别为0.4mg、0.8mg/只，B组加强免疫剂量分别0.8mg、1.6mg/只。 各鸡从免疫前5d开始收集鸡蛋，编号后于4℃保存。
1.3 卵黄抗体的提取和纯化 按参考文献进行［3,5,6］。鸡蛋外壳经75%精酒消毒后,剪一小孔, 用卵黄分离器尽量去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，用针刺破卵膜，收集卵黄液,用双蒸水将卵黄液按1:9稀释，以0.1M稀盐酸调节pH值为5.1,搅拌均匀，4℃放置12h以上.然后以5 000g低温超速离心20min，弃去沉淀,获得卵黄水提物（WSF）；在制备的水提物中加入硫酸铵至终浓度为35%,沉淀2次；然后以100KD超滤膜进行浓缩和纯化抗体。最后在蒸馏水中进行透析，过滤除菌后于-20℃保存。
1.4 效价测定 采用常规ELISA法及我们以往报道的方法进行［3,7］。包被抗原为30μg/ml的蝰蛇毒抗原液，一抗为1000倍稀释的卵黄上清液，二抗为羊抗鸡IgG-HRP（按1:5000稀释），底物为TMB溶液，显色15min后每孔加50μl 2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪上读取波长为450nm的光密度值。以免疫前卵黄上清作阴性对照，以未包被抗原的孔加入稀释后卵黄上清作空白对照.
1.5 蛋白浓度测定
1.5.1 总蛋白浓度测定 采用福林—酚试剂法（Lowry法），以BSA作为蛋白标准品。
1.5.2 总IgY浓度测定 卵黄水提物样品中总 IgY 浓度测定采用上述ELISA法进行.以100μl终浓度为10μg/ml的羊抗鸡IgG 包被酶标板, WSF用PBS稀释1 000倍，以倍比稀释的羊抗鸡IgG(100～1.56μg/ml)作为标准品绘制标准曲线.
1.5.3 抗蝰蛇毒IgY 浓度测定 按照Sunwoo et al报道的方法进行［7］,分别以100μl终浓度为10μg/ml的羊抗鸡IgG和1mg/ml的蝰蛇毒抗原包被酶标板。向包被蝰蛇毒抗原的孔内加入倍比称释的特异性IgY(12.5～1.56μg/ml)和非特异性IgY(4.5～0.28mg/ml)；向包被羊抗鸡IgG的孔内加入倍比稀释的0.1mg/ml鸡IgG抗体（100～1.56μg/ml)。 二抗、底物及吸光度测定等均按上述ELISA方法进行。
1.6 抗体的特异性及交叉反应研究 采用 ELISA进行。分别以3mg/ml蝰蛇毒、饭匙倩、蝮蛇、百步蛇及眼镜蛇毒抗原包被酶标板。 将以PBS倍比稀释的抗蝰蛇毒IgY(1～5mg/ml)与包被抗原反应， 通过比较抗蝰蛇毒IgY对以上几种蛇毒抗原的反应活性与对蝰蛇毒抗原本身反应活性之比来决定抗蝰蛇毒IgY抗体与选择蛇毒的交叉反应性。
1.7 统计学分析 所有数据用x±s表示,采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析, 两组间比较采用Student’s t-test进行，以P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 特异卵黄抗体效价动态变化规律 采用ELISA法评估了免疫期间各组抗体效价变化情况，结果如Fig.1所示。免疫后，两组卵黄中抗体逐渐增加，B组免疫效价明显高于A组（P<0.05）：B组于初免疫后约40d达效价高峰,持续约4w；而A组在初免疫后约50d达效价高峰，持续约2w。
图1 免疫期间以不同剂量蝰蛇毒抗原免疫鸡卵黄中特异性IgY的变化（略）
Fig 1 The change of specific IgY in the egg yolk from chickens immunized with different doses of viper venom antigens during the immunization period
2.2 蛋白浓度测定 总蛋白及IgY蛋白浓度测定结果Fig2所示。研究结果显示：A组总IgY浓度为(6.48±1.27)mg/ml，B组为(6.53±1.21)mg/ml，两组总IgY浓度无明显统计学差异(P>0.05)。然而，B组中特异性卵黄抗体浓度明显高于A组(P<0.05), 其中B组平均特异性IgY浓度为(0.29±0.04)mg/ml，而A组为(0.21±0.03)mg/ml。
2.3 抗体特异性及交叉反应分析 经ELISA检测，结果如Fig 3所示： 制备的抗蝰蛇毒IgY与蝰蛇毒抗原具有较高的免疫反应活性及特异性，与眼镜蛇毒抗原有轻度交叉反应，然而与饭匙倩(43.1%)、蝮蛇(47.5%)及百步蛇(54.3%) 有明显的交叉反应性。
3 讨论
在本研究中，我们以减毒的蝰蛇毒抗原免疫母鸡，从卵黄中成功的获得了抗蝰蛇毒IgY抗体。蝰蛇毒抗原易于诱导母鸡产生良好的免疫应答（Fig.1所示），其中B组于初免疫后约40d达效价高峰,持续约4w，其免疫效价明显高于A组（P<0.05），此与国内外文献报道相似［7,8］。
1992年，由Akita 和Nakai最先报道水稀释法(W.D)应用于卵黄抗体的分离提取，至此大量研究证实W.D法是一种经济、简单和高效的分离卵黄抗体的方法［2］。在本研究中，我们采用W.D法获得了较高浓度的IgY抗体，其中A组总IgY浓度为(6.48±1.27)mg/ml，B组为(6.53±1.21)mg/ml，两组总IgY浓度无明显统计学差异(P>0.05)，此与其他作者报道相似［7～9］。B组平均特异性IgY浓度为(0.29±0.04)mg/ml，明显高于A组(P<0.05), 但两组平均特异性IgY浓度均略低于国内外的一此研究［10］。其原因可能主要是由于蛇毒作为一种复杂的混合抗原，降低特异性抗体的产率；其次，抗蝰蛇毒多克隆IgY抗体的差异性也将直接影响ELISA的检测结果。
图2 A、B两组母鸡总蛋白浓度和特异性IgY浓度的比较（略）
Fig 2 The concentrations of total protein ,total IgY and specific IgY in the watersoluble fraction obtained from chickens immunized with high dose(a)and low dose(b) viper antigen during the immunization period. Vertical bars indicate the standard deviation
图3 制备的抗蝰蛇毒IgY免疫活性及特异性（略）
Fig 3 The cross-reactivity of anti-viper venom IgY with other snake venoms, including hundred pace snake, Agkisrodon,habu and cobra. Values are the mean of triplicate samples. Vertical bars indicate the standard deviation
研究表明，蛇毒是一种“嵌合体”抗原复合物，已发现在同类或甚至是不同类的蛇属中存在共同抗原。圆斑蝰是中国的十大毒蛇之一，属于蝰蛇科，与响尾蛇、五步蛇、蝮蛇及饭匙倩等毒蛇存在有较多共同抗原，而与眼镜蛇科属毒蛇如眼镜蛇等存在共同抗原较少［11,12］。本研究中，我们制备的抗蝰蛇毒IgY与五步蛇、蝮蛇及饭匙倩有明显交叉反应，而与眼镜蛇交叉反应较少(见Fig.3)，此进一步证实了圆斑蝰与五步蛇、蝮蛇及饭匙倩等毒蛇存在有较多共同抗原现象［11,12］。据此，我们推测抗蝰蛇毒IgY 也能部分中和五步蛇、蝮蛇及饭匙倩等蛇毒素。
综上，本研究制备了较高免疫特异性的抗蝰蛇毒IgY，由于鸡多克隆抗体具有制备经济、生产工艺简单、流通方便，特别是安全性好等优点，因此，抗蛇毒卵黄抗体有可能成为蛇伤治疗的新型药物。
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作者单位：广州医学院护理学院药理学教研室，广东 广州 510182; 南方医科大学基因研究所,广东 广州 510515; 中山大学附属第三医院心胸外科,广东 广州 510630