乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

【摘要】  目的 采用TaqMan技术，研究建立实时荧光逆转录聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis, JEV）的效果。 方法 根据JEV非结构蛋白基因NS3基因序列（GenBank序列号,U15763），结合生物学软件序列比对分析，设计1对特异性引物和TaqMan寡核苷酸探针,优化荧光RT-PCR反应条件后，以模板梯度稀释法及相关毒株对比扩增检验测定方法的敏感度和特异性。 结果 引物和探针最佳浓度均为0.20μM，复性温度为55℃。方法至少检测出1copy/μl 病毒RNA，与流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒均无交叉反应。从病毒核酸提取至完成检测仅需3hr左右。 结论 所建立的JEV病毒TaqMan荧光RT-PCR方法敏感特异，有助于JEV感染的实验室早期快速诊断。

【关键词】  乙型脑炎病毒 荧光RT-PCR TaqMan探针 检测

　　 Establishment of a TaqMan reverse transcription polymerase chain reaction for detection of Japanese encephalitis virus.
　　HUANG Fu-xin, GAO Shi-tong, ZHANG Ren-li, et al.

　　(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, Guangdong, P. R. China)
   
　　Abstract：Objective  To establish a specific and sensitive method for detecting Japanese encephalitis virus(JEV) nucleic acid with TaqMan reverse trascription polymerase chain reaction(RT-PCR).  Methods  Based on NS3 nucleic sequnce of JEV from GenBank (NO.U15763), a pair of primers and a TaqMan probe was designed for real-time RT-PCR. The reaction conditions were optimized using different concentration of primers and probe. Specificity and sensitivity of the TaqMan RT-PCR were also tested.  Results  The optimized concetration of the primers and probe was 0.20μM respectively. The RT-PCR was proved to be specific for detection JEV, with no cross-reactivity oberserved with influenza, measles, mumps, rubella and varicella viruses, which could detect as low as 1copy/μl of JEV RNA. The time was about 3hr for completing a detection process.  Conclusion  The established TaqMan real-time RT-PCR was specific and sensitive,  which could be useful for early and rapid laboratory diagnosis of JE.
   
　　Key words：Japnese encephalitis virus; RT-PCR; TaqMan probe; Detection

　　流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japnese Encephalitis Virus，JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病，病死率可高达25%，存活的患者中18%出现严重的神经系统后遗症。该病主要通过蚊媒传播，是一种人畜共患的自然疫源性疾病，其广泛分布流行于亚洲国家，包括日本、中国、韩国和印度等，发病率高达10/10万［1］。乙脑的早期快速诊断对于病人的救治以及疫情的及时发现和处理具有重要的意义。目前，国内乙型脑炎的诊断大多采用血清的方法（包括ELISA法、EIA法、微量免疫荧光法等），通过检测乙脑患者血清或脑脊液中乙脑病毒的特异性IgG、IgM抗体判断感染JEV的情况，因JEV病毒感染至产生抗体存在一定的“窗口期”，故不利于乙脑的早期诊断，此外同其他黄热病毒间的交叉反应亦不易消除。本研究拟采用TaqMan技术，建立一种灵敏、特异的实时荧光RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis, JEV），旨在为乙脑的早期应急及临床诊治提供准确可靠的检测手段。

　　1  材料与方法

　　1.1  病毒株  乙型脑炎SA14-14-2减毒株、麻疹减毒活疫苗株、流感病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒减毒株等由本中心保存。

　　1.2  引物与探针  根据GenBank中发布的JEV非结构蛋白基因NS3基因序列（序列号：U15763），结合生物学软件序列比对分析，设计特异性引物和TaqMan探针；引物序列：Forward Primer（FP）：5’-GCATGGAGCAGTGGATACGA-3’， Reverse Primer（RP）：5’- CTCTTTGGAGGCACATTGCA-3’； 探针Probe: 5’-FAM-TGGATCACAGAATATGCGGGCA -TAMRA-3’，5’端和3’端分别以FAM和TAMRA基团标记；引物和探针由广州达晖生物技术有限公司合成。

　　1.3  病毒RNA的提取  取适量病毒株加入1.5ml Eppendof管中，加1ml Trizol混匀，室温静置15min；再加200μl氯仿，颠倒混匀，室温静置10min，13 000rpm离心10min；取上清液转移至另一1.5ml Eppendof管，加等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10min，13 000rpm离心10min；弃上清，加1ml 75％乙醇（用DEPC水配置）洗涤沉淀，7 500rpm离心5min，吸去上清；室温干燥，加40μl DEPC水溶解RNA；－20℃冰箱保存备用。

　　1.4  病毒RNA逆转录为CDNA  逆转录体系为：5×RT buffer［50mM Tris-HCl(pH8.0),50mM KCl,4mM MgCl2,10mM DTT］ 4μl，dNTP（10mmol/μl）0.2μl，逆转录酶（200U/μl）1μl，F（10pmol/μl）0.4μl，R（10pmol/μl）0.4μl，DEPC水 9μl，RNA模板 5μl，反应总体积为20μl，反应条件：45℃ 30min，95℃ 5min，获得cDNA作PCR模板。

　　1.5  荧光RT-PCR反应体系和条件优化  在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，选用不同浓度范围的引物和探针浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度；在同一反应体系条件下，在45～65℃温度范围内选择最佳复性温度。

　　1.6  RT-PCR反应  反应体积为50μl，其中5×定量PCR buffer［10mM Tris-HCl(pH8.0),50mM KCl,2mM MgCl2］（美国ABI公司）10μl，上、下游引物（10pM/）1μl， dNTPs（10mM）（Sigma公司）1μl，荧光探针（10pM）1μl，Taq 酶（美国ABI公司）1μl，cDNA 5μl，ddH2O  30μl。反应条件为：93℃ 3min，然后93℃ 45sec，55℃ 1min，共40循环。扩增仪为PE 7000全自动荧光定量PCR仪（美国Perkin Elmer公司）。

　　1.7  荧光RT-PCR特异性和敏感性测试  将JEV、流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒分别提取核酸，采用荧光RT-PCR方法分别进行检测，验证方法的特异性；将定量的JEV核酸cDNA倍比稀释成5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copy/μl，平行进行荧光RT-PCR反应，检测其灵敏度；对每一标本作2次重复检测。

　　2  结果

　　2.1  反应体系与条件优化  在分别调整引物、探针浓度和复性温度的状况下，通过观察扩增反应的效率进行优化，引物和探针最佳反应浓度均为0.20μM；以荧光定量仪PE 7000全自动荧光定量PCR仪（美国Perkin Elmer公司）进行扩增检测，反应参数为：93℃ 3min，然后93℃ 45s，55℃ 1min，共40循环。在上述条件下JEV核酸可获得良好的扩增曲线，见图1。

　　图1  JEV核酸荧光 RT-PCR扩增曲线 （略）

　　2.2  敏感性试验  将定量的JEV核酸倍比稀释成相当于1×104、1×103、1×102、1×101、1×100，0copy/μl溶液作模板，进行荧光RT-PCR反应，结果显示荧光RT-PCR方法至少可以检测到溶液中1copy/μl的RNA病毒，见图2。

　　2.3  特异性试验  将JEV、流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒平行核酸提取、反转录和PCR扩增，结果显示仅JEV显示特异性的扩增曲线，表明该法特异性良好，与上述病毒均无交叉反应。

　　图2  荧光 RT-PCR检测JEV敏感性测试结果（略）

　　注：从左侧起扩增曲线对应的JEV核酸稀释浓度分别为1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μl

　　3  讨论
   
　　鉴于目前实验室常用病毒分离鉴定技术和血清学特异抗体检测方法操作繁琐且检测效果不理想的状况，国内外学者尝试采用以RT-PCR为核心的基因诊断技术检测JEV取得了满意的效果［2,3］。孙静等［4］采用RT-PCR用于临床疑似乙脑病人血清及脑脊液（CSF）标本的检测，并与反向被动血凝抑制实验（RPHI）方法进行比较，结果显示RT-PCR敏感性可达64 PFU，对CSF中JEV的检测率明显高于RPHI；丁淑军等［5］采用逆转录-半套式-聚合酶链反技术和IgM捕获法ELISA（Mac ELISA）比较检测临床诊断的37例乙脑和15例非乙脑病人标本，两者检测结果差异无显著性。但RT-PCR法在检测CSF具有优越性，可检出发病后22hr CSF中 JEV，而ELISA法4d后才能检出特异性抗体。由于RT-PCR特异性好、敏感性高，被大多数有条件的实验室所接受和认可。本文根据JEV非结构蛋白基因NS3基因序列，设计1对特异性引物和TaqMan寡核苷酸内探针建立了JEV实时荧光RT-PCR检测技术，敏感度测试显示该法至少检测出1copy/μl 病毒RNA,显示特异性良好，仅JEV核酸被有效扩增，与流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒均无交叉反应。从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右,与常规的RT-PCR相比具有RT-PCR结合TaqMan内探针增加了检测的敏感性和特异性［3］、扩增反应在封闭的管中实时检测，减少了交叉污染造成的假阳性及无须扩增后的电泳检测，缩短了检测时间等优点。实时荧光RT-PCR克服了传统血清学及常规RT-PCR检测JEV感染的不足，将逐渐成为一种急性期病人血清、脑脊液标本检测的新的标准方法。

【参考文献】
  ［1］ 赵荣乐, 郑光宇. 乙型脑炎病毒研究进展［J］.生物学通报, 2007, 42(7):6～8.

　　［2］ Yang DK, Kweon CH, Kim BH, et al. TaqMan reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of Japanese encephalitis virus［J］. J. Vet. Sci., 2004, 5(4):345～51.

　　［3］ 刘卫滨, 付士云, 宋宏, 等. 乙型脑炎病毒 TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用［J］. 中华微生物学和免疫学杂志, 2005, 25（8）:656～662.

　　［4］ 孙静, 陶三菊, 陈伯权, 等. 逆转录-聚合酶链反应方法检测乙型脑炎病人标本［J］.中华实验和临床病毒学杂志, 2000, 14(2): 184～187.

　　［5］ 丁淑军, 余光开, 张建军, 等. 逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立［J］.中国人兽共患病杂志, 2003, 19(1): 86～88.

作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020; 深圳市布吉坂田预防保健所，广东 深圳 518129.