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【摘要】 通过对乙型肝炎病毒外膜大蛋白（Hepatitis B virus large surface protein，HBV-LP）结构、功能的阐述，分析其检测技术的发展历程，让临床医生更深层次的了解其临床意义，为今后广泛的应用于临床做好铺垫。 HBV基因组的 S 区分为 preS1、preS2 和S基因 3 段。HBV-LP即由S、Pre-S1及Pre-S2基因区所编码。大蛋白的前 S 区具有独特的立体构象拓扑结构，是HBV-LP发挥多种功能作用的依赖性结构。拓扑结构决定其具有反式激活作用。在HBV DNA阴性的患者中，HBV-LP阳性可能是肝内病毒继续复制和抗病毒治疗不彻底的标志。使用酶联免疫定量方法检测HBV-LP与HBV DNA的检测有良好一致性，是反映HBV复制活跃的可靠指标，可以作为HBV感染、复制和乙肝患者诊断、治疗和预后的重要标志物，具有较高的临床应用价值。
【关键词】 乙型肝炎病毒外膜大蛋白（HBV-LP）；立体构象拓扑结构
乙型肝炎病毒（Hepatitis B viruses，HBV）感染是一个严重的公共卫生问题，其中慢性HBV感染者约占世界的1/3［1］。目前临床上主要以肝功能的改善，HBeAg血清转换和HBV DNA阴转作为乙肝患者病毒复制与抗病毒疗效的监测指标，但尚有一定的局限性。有研究发现，用拉米夫定等核苷酸类似物抗病毒治疗时，如果HBV DNA的拷贝数与HBeAg同时下降或阴转则疗效和预后较好；如果只有HBV DNA下降，HBeAg含量不变或下降不明显，则停药后病毒反弹的可能性大。因此对HBeAg阴性慢性乙肝患者缺乏准确反映体内病毒复制与抗病毒疗效的血清学指标。有学者一直在研究寻找新的或更有意义的抗病毒监测指标。近几年乙肝病毒外膜大蛋白（Hepatitis B virus large surface protein，HBV-LP）作为一种新的可靠的定量血清免疫学指标，越来越受到重视。本文就乙肝病毒外膜大蛋白的结构、功能及其在乙型肝炎诊治中的检测意义做一综述，为今后评估其能否作为抗病毒监测指标提供一定的理论依据，从而更好地为临床服务。
1 乙肝病毒外膜大蛋白的结构
HBV基因组的 S 区分为 preS1、preS2 和S基因 3 段，它们阅读框相位相同，连续串联排列，可以共用1个终止密码子。这3个基因分别编码三种表面包膜蛋白：（ 1 ）主要表面蛋白：简称主蛋白，由S基因编码，是病毒包膜及亚单位颗粒的主要成分，因其分子量小，因此称之为小蛋白，传统上 HBsAg 即指由S基因编码的蛋白；（ 2 ）中等分子S蛋白（ M 蛋白）：由S及 Pre-S2 基因区所编码；（ 3 ）大分子S蛋白（ L 蛋白，即HBV-LP），由S、Pre-S1及Pre-S2基因区所编码。 HBV 感染者血清中有 3 种不同形态的病毒颗粒：小球形颗粒（直径 22nm ）、管形颗粒（直径 22nm 、长度100～1 000nm ）、 Dane 颗粒。在感染的病人血流中大多数为小球形颗粒，仅由主蛋白或约5%中蛋白组成。病毒复制期病人同时有少数管形颗粒，由主蛋白、2%～5%中蛋白和5%～10%大蛋白组成。上述两种颗粒是空缺的外膜，不含病毒核心。Dane 颗粒是完整的病毒颗粒，仍以主蛋白为主，5%～10%中蛋白，而大蛋白可达20%。在肝内病毒非复制期，大蛋白在血清中很低或无，大量滞留在肝细胞中。因此可以根据检测血液中大蛋白的有无，来判断病毒携带者体内的 HBV 病毒是否在进行复制。
2 乙肝病毒外膜大蛋白的功能
由于基因组较小，病毒都是利用尽可能小的多肽序列储存尽可能多的信息。因此，很多由病毒编码的蛋白和蛋白结构域都具有多种功能。HBV-LP即是其中的一个例子。该蛋白在病毒进入时作为受体蛋白起作用；在病毒组装时，则是基质类似蛋白，同时还行使调节功能。乙肝感染通常导致10 000倍多于病毒粒子的管状亚病毒颗粒(Subviral particles，SVPs) 的合成。 SVPs 包含宿主细胞来源的脂质和病毒衣壳蛋白，但不具有病毒核衣壳蛋白和核酸。HBV的衣壳大蛋白，在病毒生活周期中具有一系列不同的功能：感染早期，与细胞受体结合介导病毒粒子的细胞内摄入；感染晚期，他们对于病毒粒子的组装和分泌十分重要。大蛋白的前 S 区具有独特的立体构象拓扑结构，这个特殊的结构是HBV-LP发挥多种功能作用的依赖性结构［2］。最新的研究证明大蛋白上的前S区 AA99-169 （横跨部分前 S1 和前 S2 ）形成一个环状，具有表面抗原众多的免疫表位［3］，其中Arg 103和Ser 124 之间的序列在不同的 HBV 之间是高度保守的。Arg 103和Ser 124 之间的pre-S序列对于 HBV 的形成具有重要功能［4］，而这个区段也是横跨前S1和前S2的。在组装病毒外壳时，大蛋白在主蛋白和中蛋白的协同作用下，分泌出组装完整病毒外壳，如果缺乏大蛋白，则只能形成不完整的病毒颗粒（球型颗粒）。研究鸭乙肝病毒发现含有嗜肝病毒的血清的感染性不仅依赖于具有感染性的病毒颗粒（Dane氏颗粒）的多少，而且还依赖于缺乏核酸的亚病毒颗粒的数量，亚病毒颗粒在HBV感染过程中，能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达 , 而这种增强作用是由大蛋白上的pre-S蛋白的反式激活作用所触发的［5,6］，通过对HBV-LP的研究发现，HBV-LP独特的拓扑结构决定其具有反式激活作用，HBV-LP的前S1区和前S2区有一个与翻译不同步的转位过程，在横跨内质网膜时指向内质网的胞质侧，HBV-LP上的前S2区段在翻译后初期定位于内质网的胞质侧，能够激活多种启动子元件，具有同样的转录激活功能。慢性 HBV 感染患者体内HBV-LP持续过量表达，转录反式激活病毒的启动元件与病毒复制密切相关。
3 乙肝病毒大蛋白检测技术的发展
早在上个世纪 80 年代，关于大蛋白前S蛋白与乙肝病毒复制的关系已经引起了人们的广泛注意，检测的意义得到科研领域公认。但是检测前S抗原的手段缺乏，临床应用不广。到90年代，从蛋白组成上认为前S1是HBV大蛋白所独有的片断，因此它作为乙肝病毒复制的新标志一直是乙肝检测领域研究的热点, 关于前S区的研究主要是将前S1 和前S2作为两个独立的单元进行研究［7］。90年代中期，我国已经有商品化的前S1定性检测试剂，但只能检测到微弱的抗pre-S1抗体的产生。90年代末，军事医学科学院马贤凯等人使用基因重组的前S抗原制备多抗组装成试剂盒，在大、小三阳患者检出率没有显著的差异，且与HBV复制的相关性也不够高，没有见后来有相关的文章发表［8］。此外由于HBV-LP表达具有很强的细胞内滞留性，因此HBV-LP前S抗原难以体外重组表达，同时该HBV-LP极容易降解，因此将HBV-LP前S区作为一个整体对其蛋白功能研究相对较少。国内近期才有完整表达前S区抗原成功［9］。而在国外，对于S区抗原检测的研究，开始于1984年，德国科学家 Klaus H.等人使用乙肝感染者的血清分离出乙肝病毒颗粒，分离出一株单抗，该单抗后来确定为前S1区的线性表位AA31-33区段的单抗，没有在临床诊断中应用。从90年代到现在，针对前S区蛋白的整体性构象型蛋白研究日益受到重视［10］。德国法兰克福州吉森大学的Bruss V实验室研究证明大蛋白上的前S区 AA99-169 （横跨部分前S1和前S2）形成一个环状，具有表面抗原众多的免疫表位［11］，其中Arg 103和Ser 124之间的pre-S序列对于HBV的形成具有重要功能，而这个区段也是横跨前S1和前S2的。而由大蛋白组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制也有相关乙肝鸭模型证实。这个对于临床具有实际的意义，在临床上，一定比例的小三阳病人抗病毒治疗后［DNA阴性（低拷贝数）但是存在亚病毒颗粒（前S抗原阳性）］容易停药反跳之间的关联有新的启示。
对于 HBV 外膜蛋白的深入研究，发现大蛋白在完整病毒外壳组装过程中起着决定性作用［12］。整个前 S 区都暴露在病毒颗粒的表面，大蛋白在穿越内质网时需要形成双重拓扑结构，大蛋白的折叠使前S区形成一个结构型依赖的区域。表位的构成方式至少有两种：①线性表位。②构象表位。病毒抗原的免疫检测的研究中，大多数都采用病毒的部分基因重组抗原或合成的多肽制作的单抗。近年来，人们逐渐认识到合成的多肽一般只具有线性表位，而不具有抗体所识别的构象型表位。当病毒的优势抗原表位是具有立体空间构象型的抗原表位时，采用基因重组或合成肽的抗原制作的单抗其检测病毒抗原的灵敏度必定受到影响［13］，所以最好的办法是采用病毒样颗粒上的天然抗原决定簇或者能模拟其结构的重组蛋白来制作出针对其构象型表位的单克隆抗体。因此 , 针对HBV-LP拓扑结构的特异性单抗是检测HBV-LP的较好选择。
4 乙肝病毒大蛋白的临床应用价值及意义
HBV-LP的检测是通过酶联免疫法（ELISA）。而ELISA一直是临床上用于乙肝病毒感染的血清检测手段。传统认为乙肝两对半中HbeAg阳性表明HBV复制活跃、传染性较强［14］，HbeAg阴转是HBV复制减弱、传染性降低和预后良好的象征。而杨延敏等［15］研究显示，在133例HbeAg阴性患者中HBV DNA与HBV-LP的阳性率分别为41.16%和44.16%，可能是免疫清除不全或是HBV基因前C区变异所致，多为慢性乙肝，而且此类患者发生肝硬化、肝癌的风险较大。ALT是判断肝内炎症活动度的可靠指标，临床通常将血清转氨酶水平变化作为乙肝患者病情转归的一个重要指标。此研究也显示，HBV-LP阳性的ALT水平明显高于HBV-LP阴性的患者，说明HBV-LP阳性患者较阴性患者肝组织损伤严重，这与HBV-LP阳性标志着存在HBV复制相符合。同时国内外研究表明，HBV-LP是导致肝细胞病变及凋亡的主要原因［16］，这个结果表明，HBV-LP可用于观察临床疗效和估计预后。国内有学者研究也发现，HBV-LP在HBV感染血清中较HBVpreS1，HBVpreS2，HBV DNA，HbeAg敏感，分析其原因可能是：HBV-LP检测采用的是立体构象型表位的单克隆抗体，HBVpreS1，HBVpreS2作为HBV-LP的一部分，无法模拟其复杂的双重拓扑结构，在制作单克隆抗体时由于序列的折叠、卷曲而失去表位表露的机会导致漏检。另外，HBV突变株不断增加、HBV DNA检测的方法学与灵敏度缺陷等使HBV DNA阴转并不能真实反映肝组织内HBV感染及复制情况，尤其是HBV DNA低水平时，肝内HBV DNA仍可维持一定水平。目前抗病毒治疗只能抑制cccDNA再复制，并不能抑制已经形成的病毒表达蛋白，富含大蛋白的亚病毒颗粒在一段时间内仍存在。由于持续免疫压力、长期治疗、前C和C启动子变异原因，HbeAg阴性的慢性乙肝流行率呈不断升高趋势，HbeAg的阴转已不能真实反映HBV复制情况。以上表明，HBV-LP是用于HBV感染者机体内病毒复制监测及疗效判断的良好指标。另有研究发现，在检测的DNA阴性的乙肝患者血清标本中，有一部分检测到了HBV-LP的存在，而他们正处于抗病毒治疗过程中。这一现象提示我们，在HBV DNA阴性的患者中，HBV-LP阳性可能是肝内病毒继续复制和抗病毒治疗不彻底的标志。但是这一结论还需要大量的临床研究来证实。HBV-LP一直是在检验学领域研究，关于这方面的科研研究也并不多。HBV-LP何时能被广大临床医生所了解和运用，还需要一定的时间。随着乙肝抗病毒治疗手段的不断发展，原有的监测指标已不能满足医生、患者对慢性乙肝治疗结果的评估，目前有专家提倡，HBV DNA阴转、e抗原血清转换已不能作为治疗的终点，而是考虑HBsAg的阴转作为治疗的终点。因此，今天探讨HBV-LP是否可作为临床乙肝患者抗病毒治疗监测指标之一是有一定理论依据的，不论是检测方法还是临床应用上，HBV-LP都有它的优越性。相信在不久的将来，HBV-LP会被广大医生逐渐认知，并应用于临床。
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作者单位：沈阳市第六人民医院,辽宁 沈阳 110006.