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【摘要】 目的 建立婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。方法 根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因序列，设计两对特异性引物。对反应条件进行优化，建立针对婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法，并对奶粉进行模拟检测。结果 两对引物能特异扩出282bp和482bp的目的条带；在优化条件下，可同时检测模拟样品中两菌DNA，灵敏度达到103CFU/ml。结论 与传统方法比较,研究建立的多重PCR方法敏感、特异，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。
【关键词】 奶粉;多重PCR;阪崎肠杆菌;金黄色葡萄球菌
Establishment of a multiple PCR method for detection of Enterobacter sakazakii and Staphylococcus aureus in powdered milk.
LIANG Hui-ying, HOU Dian-dong, HU Ying, et al.
1. College of Public Health, Chinese Medical University, Shenyang, 110001;
2. Basic Collegel of Liaoning University of Chinese Traditiona Medicine, Shenyang 110001, Liaoning, P. R. China
Abstract：Objective To establish a multiple PCR method for detection of common pathogenic bacteria such as Enterobacter Sakazakii and Staphylococcus aureus in powdered milk. Methods Two pairs of oligo-nucleotide primers were designed and synthesized to amplify the special DNA sequences by multiple PCR. Moreover, the reaction conditions of multiple PCR were optimized and the method was put in practice. Results The results showed that the multiple PCR obtained specific amplicons of expected sizes, 282bp for Enterobacter Sakazakii, 484bp for Staphylococcus aureus by using the two pairs of primers. Under the optimized reaction conditions, the detection limits for DNA template were 105CFU/ml. Conclusion The multiple PCR assay was a specific, sensitive, rapid and reliable method for detecting Enterobacter Sakazakii and Staphylococcus aureus.
Key words：Multiple PCR; powdered milk; Enterobacter sakazakii; Staphyloco-ccus aureus
金黄色葡萄球菌(Staphy lococcus aureas)和阪崎肠杆菌均为污染奶及其制品的常见病原菌，可同时出现在婴幼儿配方奶粉等奶制品中，快速检测对于控制其传播、保证婴幼儿安全饮食具有重要意义［1,2］。本研究建立了可同时检测阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR技术，为快速检测奶制品中病原菌提供了新的手段。
1 材料和方法
1.1 材料
实验采用的菌株［阪崎肠杆菌(2株)、金黄色葡萄球菌（2株）］均由辽宁省疾病预防控制中心提供。Taq DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、DNA Marker DL2000，均购自大连宝生物工程有限公司；Gene Finder购自厦门百威信生物科技有限公司；MLST培养基、脑心浸液和营养肉汤，购自北京陆桥技术有限责任公司。其它试剂均为分析纯。阪崎肠杆菌根据ompA基因，金黄色葡萄球菌根据nuc基因序列，采用引物设计软件Primer 5.0和Oligo 6.0分别自行设计引物EF、ER和SF、SR，委托大连宝生物工程有限公司合成，扩增片段为282bp和482bp。引物序列如下：EF：5'-GGATTTAACCGTGAACTTTTCC-3'ER：5'-CGCCAGGGATGTTAGAAGA-3'SF：5'-GCTTGCTATGATTGTGGTAGCC-3'SR：5'-CTCTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3'
1.1.1 保质期内袋装奶粉 购自超市。
1.2 方法
1.2.1 菌种准备
将试验所用各菌株分别接种至营养肉汤中, 37℃过夜培养备用。
1.2.2 模板DNA的制备
参考文献［3］进行。
1.2.3 多重PCR反应条件优化
以阪崎肠杆菌标准菌株和金黄色葡萄球菌ATCC6538的混合DNA为模板，对多重PCR各反应条件进行优化。初始反应条件（25μl）包括10×PCR 缓冲液3μl，20mmol/L Mg。2＋3μl，2.5mmol/L dNTP 3.0μl，2.0μmol/L两对引物各1.0μl，2U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl。然后，研究退火温度、Mg2+浓度和引物浓度等对PCR影响较大条件的优化。
1.2.4 PCR扩增产物的电泳检测
取5μl PCR扩增产物加2μl上样液混匀，以DNA Marker DL2000作相对分子质量指示，用1.5％琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）在100V电压下电泳45min，置凝胶成像系统中进行结果分析。
1.2.5 特异性测定
对供试的2株阪崎肠杆菌和2株金黄色葡萄球菌进行PCR特异性检测。同时将经传统方法鉴定的2株菌株（1株李斯特菌、1株沙门菌）作为干扰菌进行PCR特异性验证。
1.2.6 灵敏度测定
取阪崎肠杆菌标准菌株和金黄色葡萄球菌ATCC6538，分别配制106CFU/ml的细菌菌液后，利用超纯水按10倍梯度递增稀释，使各菌液浓度依次为106～101CFU/ml, 以麦氏比浊法行菌落计数测定。取各浓度菌液1ml，用1.2.2方法提取DNA,进行PCR检测，得出检出限。
1.2.7 模拟样品的检测
参考文献［3］进行。
2 结果
2.1 多重PCR引物的特异性分析
应用所设计的两对特异性引物分别进行PCR检测，结果供试的2株阪崎肠杆菌均出现282bp的扩增条带,2株金黄色葡萄球菌均出现482bp的扩增条带，引物间无交叉反应。PCR扩增电泳检测结果见图1。
2.2 多重PCR反应条件优化
为使多重PCR体系中各对引物均能得到高效的扩增，首先通过预实验确定了影响较小的因素10×PCR 缓冲液3μl，dNTP浓度300μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.5U。在此基础上对反应体系中退火温度、Mg2＋浓度、引物浓度三个重要参数进行了棋盘滴定式的优化实验。
2.2.1 退火温度对多重PCR反应的影响
在53.2～60℃之间均能扩增得到目的片段，但最佳退火温度在55.6～59.1℃。
2.2.2 Mg2+浓度对多重PCR反应的影响
在上述最佳退火温度下，加入不同浓度的Mg2＋，以研究Mg2＋浓度对多重PCR反应的影响。在Mg2＋浓度为2.4mmol/L时可得到均一、稳定、清晰的扩增条带。
2.2.3 引物浓度对多重PCR 反应的影响
两对引物分别选用了6个浓度梯度来研究引物浓度对PCR反应的影响，首先加入等量引物，再根据条带的亮度调整各引物的浓度。最佳引物浓度阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别为40nmol/L和80nmol/L。优化的多重PCR反应条件: 10×PCR缓冲液3μl，2.4mmol/L Mg2＋，300μmol/L dNTP，引物浓度为：阪崎肠杆菌40nmol/L、金黄色葡萄球菌80nmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U。循环参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸10min。
2.3 多重PCR的灵敏度测定
由图2可见，利用本实验建立的多重PCR方法检测，两种细菌在106～103CFU/ml浓度下均可同时扩增出清晰的条带，阪崎肠杆菌在102CFU/ml浓度下仍然可见到条带。
2.4 模拟样品的检测
由图3可知，无论是单独污染，还是联合其它干扰菌一起污染，本方法均能够从模拟样品中检出特异性的目的片断，阴性对照无此扩增产物。干扰菌均采用6cfu/100g的浓度进行污染操作。
3 讨论
本研究建立的多重PCR方法，系根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A(OmPA)和金黄色葡萄球菌nuc基因序列设计引物；在前期工作基础上，优化反应条件，并利用人工染菌奶粉对技术指标做出评价。多重PCR影响因素复杂，反应体系中的各组分会对扩增结果产生综合效应［4］。本研究选取对扩增效率影响较大的的退火温度、Mg2＋浓度、引物浓度三个重要参数进行优化研究，获得了较好的灵敏度实验结果。为研究如何避免奶粉样品中某些物质时干扰可能造成的假阴性，实验中还实施模拟样品检测：先对人工污染奶粉进行增菌培养，接着以PCR方法检测其培养物。结果表明，只要奶粉经28h增菌，那么无论是将阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌两者联合接种，还是与李斯特菌或沙门菌一起接种，均可检出特异性扩增产物，而且证实不会受到其它细菌的干扰。
【参考文献】
［1］Barbara M.L, Tony C.B, Grahame W.G. The Microbiological Safety and Quality of Food［J］. Gaithersburg, Maryland, USA: Aspen publishers, 2000.
［2］苏世彦.食品微生物检验手册［M］.北京:中国轻工业出版社,1998.
［3］周吉海,侯殿东,胡英,等.PCR法检测阪崎肠杆菌的研究［J］.中国热带医学, 2008, 8(2): 186～187.
［4］Block C, Peleg O, Minster N, et al. Cluster of neonatal infections in Jerusalem due to unusual biochemical variant of Enterobacter sakazakii［J］. Eur J Clin MicrobioI Infect Dis, 2002, 21(8):613～616.
作者单位：1.中国医科大学公共卫生学院，辽宁 沈阳 1100012.辽宁中医药大学基础医学院,辽宁 沈阳 110001； 3. 辽宁省疾病预防控制中心,辽宁 沈阳 110001.