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【摘要】 目的 验证复方银耳鱼肝油微生物限度检查方法的专属性和有效性。方法 采用平皿法和薄膜过滤法对复方银耳鱼肝油进行验证试验，并测算菌回收率。结果 复方银耳鱼肝油采用平皿法和薄膜过滤法检查，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%；乙型副伤寒沙门菌以平皿法或薄膜过滤法可检出。结论 复方银耳鱼肝油可以用平皿法或薄膜过滤法进行微生物限度检查。综合考虑，在生产检验中选择采用平皿法。
【关键词】 复方银耳鱼肝油；微生物；限度检查；验证
复方银耳鱼肝油是由鱼肝油和银耳糖浆等制得的一种糖浆剂，为淡黄色透明或半透明粘稠液体［1］。复方银耳鱼肝油为维生素类非处方药品，所含维生素A和D是人体生长发育的必需物质，对于上皮组织的完整性,视力、血钙和磷的恒定,骨骼、牙齿的生长发育等有重要作用，主要用于预防和治疗人体维生素A和D缺乏症。为保证药品的质量，按照中国药典2005版［2］的要求，对其微生物限度检查方法进行研究。
影响微生物限度检查的因素比较复杂［3］。试验时要保持一个相对洁净的环境。本次验证在本公司微生物限度检查室进行。该功能间为本公司GMP体系的一部分，环境洁净度达到万级，操作区域为百级的单向流空气区域（百级工作台）。检验环境符合规定。
1 实验材料
1.1 培养基
营养琼脂培养基（批号200606156），玫瑰红钠琼脂培养基（批号200603084），胆盐乳糖培养基（批号20060221），改良马丁琼脂培养基（批号20060120），MUG培养基（批号20060502），四硫磺酸钠亮绿培养基（批号200605116）、胆盐硫乳琼脂培养基（批号200603102）、麦康凯琼脂培养基（批号200603022）。均购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 菌种
大肠埃希菌［CMCC(B)44102］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，乙型副伤寒沙门菌［CMCC(B)50094］，白色念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉菌［CMCC(F)98003］，均购自中国生物制品检定所。
1.3 稀释液
pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液。
1.4 样品
复方银耳鱼肝油（海南青鲨赐药业有限公司，批号080405，080406，080407）。
2 方法
2.1 供试液制备
从2个包装中取样品10ml，加入pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，直接混匀，制成1：10供试液。
2.2 菌液制备
（1）分别取大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌35～37℃；乙型副伤寒沙门菌35～37℃培养18～24h的营养肉汤培养物1ml，加9ml 0.9%灭菌氯化钠溶液分别10倍稀释成10-5～10-7菌液，选择50～100cfu/ml的菌液浓度备用。（2）取经23～28℃培养1周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加3ml 0.9%灭菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，取出菌液用比浊管比浊后，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成10-4～10-5菌液，选择50～100cfu/ml菌液浓度备用。取经23～28℃培养24h的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成10-5～10-6菌液，选择50～100cfu/ml菌液浓度备用。
2.3 回收率测定
2.3.1 平皿法
（1）试验组: 取1：10供试液1ml加大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液1ml注入平皿后，立即倾注琼脂培养基，平行制备两个平皿。（2）菌液组:取上述试验菌各1ml注入平皿后，同法制备两个平皿。（3）供试品对照组: 取1：10供试液1mL注入平皿后，同法制备两个平皿。（4）同时做稀释液和培养基阴性对照。
2.3.2 薄膜过滤法（滤膜孔径0.45μm）
(1)试验组: 取1：10供试液1ml加稀释液至20ml混匀，过滤，以100ml稀释液分2次冲洗，再将加有1ml大肠埃希菌的稀释液100ml过滤后，将薄膜正贴于备妥的营养琼脂平板上，平行制备两个平皿。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液照上述方法分别制备两个平皿。(2)菌液组:取上述已制备好的大肠埃希菌菌液1ml加入100ml稀释液中，混匀后过滤，同法制备两个平皿。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液照上述方法分别制备两个平皿。(3)供试品对照组: 取1：10供试液1ml加稀释液至20ml混匀，过滤，以100ml稀释液分2次冲洗后，同法制备两个平皿。(4)同时做稀释液、冲洗液和培养基阴性对照。
2.4 细菌总数、霉菌及酵母菌总数检查
采用常规法即平皿法或采用薄膜过滤法。
2.5 控制菌检查
2.5.1 平皿法
(1)大肠埃希菌检查: 取1：10供试液各10ml，加入到3个100ml胆盐乳糖培养基中。一瓶加入1ml大肠埃希菌液作为阳性对照，一瓶加入1ml金黄色葡萄球菌液作为阴性对照，一瓶作为供试品，均培养18～24h。取上述培养物做MUG和靛基质试验。(2)乙型副伤寒沙门菌:取供试品各10g，加入到3瓶200ml营养肉汤培养基中。一瓶加入1ml乙型副伤寒沙门菌作为阳性对照，一瓶加入1ml金黄色葡萄球菌液作为阴性对照，一瓶作为供试品，用匀浆仪混匀，均培养18～24h。取上述培养物1ml 接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24h做划线试验。(3)同时做稀释液、冲洗液和培养基阴性对照。
2.5.2 薄膜过滤法（滤膜径0.45μm）
（1）大肠埃希菌检查: 取1：10供试液10ml 3份。一份加稀释液至40ml混匀，过滤，以100ml稀释液分2次冲洗后，再将加有1ml大肠埃希菌菌液的稀释液100ml过滤，做为阳性对照。一份加稀释液至40ml混匀，过滤，以100ml稀释液冲洗，再将加有1ml金黄色葡萄球菌液的稀释液100ml过滤，做为阴性对照。一份加稀释液至40ml混匀，过滤，以100ml稀释液冲洗，作为供试品。分别将滤膜投入100ml胆盐乳糖培养基中，培养18～24h，取上述培养物做MUG和靛基质试验。（2）乙型副伤寒沙门菌检查:取供试品10g三份，一份加稀释液至40ml混匀，过滤，以100mL稀释液分2次冲洗后，再将加有1ml乙型副伤寒沙门菌菌液的稀释液100ml过滤，做为阳性对照。一份加稀释液至40ml混匀，过滤，以100ml稀释液冲洗，再将加有1ml金黄色葡萄球菌液的稀释液100ml过滤，做为阴性对照。一份加稀释液至40ml混匀，过滤，以100ml稀释液冲洗，作为供试品。分别将滤膜投入200ml营养肉汤培养基中。培养18～24h。取上述培养物1ml 接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24h做划线试验。（3）同时做稀释液、冲洗液和培养基阴性对照。
3 结果
经微生物限度检查方法学验证表明，复方银耳鱼肝油以平皿法或薄膜过滤法检查，大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌回收率均大于70%。以平皿法或薄膜过滤法检查，黑曲霉菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，符合方法学验证规定。控制菌以平皿法或薄膜过滤法均可检出，方法具有专属性。
4 讨论
4.1 复方银耳鱼肝油可以采用平皿法或薄膜过滤法进行微生物限度的检查。
4.2 平皿法是一种操作相对简便的微生物限度检查方法［4］。
4.3 在生产检验中考虑到经济性及方便操作，选择采用平皿法。
【参考文献】
［1］国家药品标准.WS-10001-(HD-1099)-2002.复方银耳鱼肝油［S］.
［2］中国药典2005年版［S］.二部.2005,附录93～99.
［3］向东. 影响微生物限度检查及方法验证的因素分析［J］. 现代医药卫生，2007，23（15）：2329～2330.
［4］朱会琴，李奋勇，李凯，等.几种微生物限度检查方法的比较［J］.西北药学杂志，2007，22（6）：323～324.
作者单位：海南青鲨赐药业有限公司，海南 海口 570311.