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【摘要】 目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为甲状腺细胞的可行性。 方法 E14小鼠ESCs诱导发育为拟胚体，再逐步添加促甲状腺素（TSH）、胰岛素（insulin）、KI等共培养。观察细胞分化过程的形态学变化，并以体外培养的成年小鼠甲状腺细胞为阳性对照；RT-PCR法检测甲状腺细胞分化相关基因TSHR、PAX8、NIS、TPO、Tg等表达情况；激光共聚焦显微镜双色荧光检测甲状腺细胞分化标记物PAX8和TTF-1的共表达;在荧光检测得甲状腺细胞分化率的基础上，送检电镜观察分化细胞的超微结构。 结果 诱导培养第6d分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8、NIS、TPO、Tg、TSHR的表达；第8d检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR、TTF-1、 PAX8、TTF-2 的表达；细胞形态类似对照甲状腺细胞。 结论 ESCs经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。
【关键词】 干细胞；分化；甲状腺；拟胚体
Experimental study on directed differentiation of embryonic stem cells into thyrocyte-like cells in vitro.
ZHANG Hong, JIANG Ning-yi, LIU Sheng, et al.
( Nuclear Medicine Department, the Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120, Guangdong, P. R.China )
Abstract: Objective To investigate the feasibility of directed differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into thyrocyte-like cells in vitro. Methods Murine E14 ESCs were cultured in methylcellulose semisolid medium to form embryoid bodies (EBs). These EBs were transferred for further inductive culture with the stepwise addition of growth factors-TSH, insulin and KI into the culture medium. During differentiation, cell morphology was observed through phase contrast microscopy and compared with the normal thyroid cells from mouse. The molecular markers of thyroid cells were performed by indirect immunofluorescsent analysis under fluorescsent microscopy. Gene expressions of thyroid specific mRNA were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for molecules TSHR, PAX8, NIS, TPO and Tg. Results After EBs formation, on day 6 of further culture added with inductive factors TSH,insulin and KI, ESCs-derived cells expressed thyroid-specific genes such as PAX8, NIS, TPO, Tg and TSHR. On the eighth day, these ESCs-derived thyrocyte-like cells expressed TSHR, TTF-1, PAX8 and TTF-2. Morphology of these markers positive differentiated cells was similar to those normal thyroid cells. Conclusion ESCs can differentiate into thyrocyte-like cells under given inductive conditions and related growth factors in vitro.
Key words: Stem cells; Differentiation; Thyroid gland; Embryoid body
近年来，甲状腺疾病的发生率逐年升高，各种治疗方法如甲状腺肿瘤的手术，有些涉及到甲状腺全切除或次全切除，导致术后甲状腺功能减退；甲状腺机能亢进症的放射性核素131I治疗疗效确切，但其最大的不足是出现甲状腺功能减低症；另外，先天性因素导致的甲状腺疾病日渐增多，如先天性甲状腺功能减低症，发病率大约在1/3000-1/4000[1]之间。如何避免这些甲状腺功能低下患者永久性服用甲状腺素等，并提高其生活质量，是当前亟待解决的问题。目前关于胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)的研究不断增多，技术也不断完善，这为治疗甲状腺功能低下提供了新的研究思路。
本研究旨在探讨ESCs体外定向诱导分化为甲状腺细胞的可行性和分化相关的调节因子，为ESCs源性甲状腺细胞替代治疗甲状腺功能低下提供基础资料。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 E14小鼠ESCs细胞株由美国哈佛大学Dr.Xu教授惠赠，中山大学附属第二医院脐血库保存。Balb/c孕鼠及昆明种小鼠购自中山大学实验动物中心。
1．1．2 细胞培养试剂 高糖DMEM培养基、IMDM培养基、RPMI-1640培养基、甲基纤维素、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺，（Gbico）ESCs培养专用胎牛血清、0.25%胰蛋白酶含0.04% EDTA)，(Hyclone硫代甘油、明胶、促甲状腺素(TSH)、 维生素C(VitC)、 胰岛素(insulin)、KI、促甲状腺素受体(TSHR)抗体、anti-rabbit IgG cy3 conjugate，（Sigma）重组小鼠白血病抑制因子(rmLIF)（Chemicon），Trizol、Taq酶、dNTP、ThermoScriptTMRT-PCR System(Invitrogen), PAX8抗体、TTF-1抗体、TTF-2抗体。
1．2 方法
1．2．1 鼠胚成纤维细胞（MEF）饲养层的制备 取孕期12.5～14.5d的Balb/c孕鼠，拉颈处死，无菌条件下剥出鼠胚，除去头、尾、四肢和内脏，洗去血污，剪成1～3mm3组织块，移至一无菌离心管内， PBS洗至液体基本无色，吸去PBS，加入2～3倍体积0.25% 胰蛋白酶-0.04% EDTA消化液进行消化， 37℃振荡10～15min，中止消化，静置使组织块沉降，吸取上部细胞悬液至无菌试管中，重复消化剩余胚胎组织。将收集的细胞悬液离心（1000r/min,5min），弃上清夜，加入含10%特级胎牛血清的H-DMEM培养液，重悬细胞，分种至25cm2 的细胞培养瓶中（ρ=5×106个/ml），置37℃、5%CO2培养箱中静置培养。待细胞铺满培养瓶时，进行消化传代。获得的细胞在5代内用作饲养层。
1．2．2 E14细胞的培养传代及脱饲养层培养 E14胚胎干细胞可直接接种于上述MEF细胞上培养传代，培养基为含15% ESCs专用血清的高糖DMEM培养基，添加1.5×10-4mol/L硫代甘油、0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺及双抗。脱饲养层培养时，将细胞接种于铺有0.1%明胶的培养瓶中，培养液同上，但添加2000u/ml的rmLIF。
1．2．3 拟胚体（Embryoid Bodies，EBs）形成及定向诱导 将E14小鼠ESCs以2×104个/ml的密度接种于60mm细菌培养皿悬浮培养6d，培养基换为含15% ESCs专用血清的IMDM + 0.9%甲基纤维素，同时添加1.5×10-4mol/l硫代甘油、0.28μmol/l抗坏血酸，0.1mmol/l非必需氨基酸、2mmol/l L-谷氨酰胺、1mU/ml TSH、10μg/ml胰岛素及双抗。
1．2．4 进一步向甲状腺细胞诱导分化 将d6 EBs直接接种于铺有0.1%明胶的6孔板及12孔板继续培养11d，培养基用含15% ESCs专用血清的IMDM，添加因子同拟胚体培养，在培养的第13d加入4×10-6mol/l KI。对照诱导组不加TSH、胰岛素和KI。
1．2．5 分化细胞的分析鉴定 于培养第0d、6d、10d，分别用Trizol试剂提取培养细胞总RNA，方法参照试剂说明书。检测Oct4、PAX8、TPO、Tg、TSHR及NIS基因转率水平表达情况，以β-actin为对照。RT-PCR定性分析方法参照ThermoScriptTM RT-PCR System试剂盒说明。以Oligo(dT)20为引物反转录合成第一链cDNA。以各分子的特异引物序列进行PCR，条件为：93℃预变性3min，93℃变性45s、53～65℃（视具体引物）退火30s、72℃延伸45s，进行35 个循环，72℃延伸10min后4℃保存；分别取诱导培养第8d、10d的细胞进行免疫荧光分析。将诱导分化的细胞以PBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定20min，0.1% Triton X-100 室温渗透7min，山羊血清封闭液处理20min，加入兔抗小鼠一抗，37℃保湿孵育1～1.5h，PBS洗涤3次，加入羊抗兔二抗，37℃保湿孵育，时间视情况而定；诱导培养的第16d胰酶消化6孔板中的贴壁诱导细胞，中止消化后离心重悬，种植于24孔板中，第2d贴壁后进行双色荧光分析。将贴壁细胞以新鲜配制的冷PBS洗涤3次，95％的酒精室温固定10min，0.1% Triton X-100 室温渗透3min，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭处理30min；用含1％BSA及鼠抗鼠TTF1和羊抗鼠PAX8一抗混合物的PBS 4度孵育过夜；冷PBS洗涤3次，5min/次；用含1％BSA及兔抗鼠CY3和兔抗羊FITC混合物的PBS室温孵育半h；冷PBS洗涤3次，5min/次；激光共聚焦显微镜观察双色荧光染色。12孔板中的EB诱导细胞直接固定后行双色荧光染色，方法同消化后重悬细胞；电镜观察 诱导培养结束后胰酶消化诱导细胞，中止消化后离心，细胞沉淀经固定、脱水、包埋等处理后行透射电镜观察。取成年昆明种小鼠甲状腺组织进行成体甲状腺细胞(Thyroid Epithelial Cells，TEC)体外培养，培养基为含10%特级胎牛血清的RPMI-1640，添加0.1mmol/l非必需氨基酸、2mmol/l L-谷氨酰胺及双抗。作为形态学对照，显微镜下逐日观察诱导细胞形态学变化。
2 结果
2．1 形态学观察结果 饲养层细胞呈长梭形、多角形、不规则形生长，边界欠清晰。未分化E14小鼠ESCs体积小，为圆形或椭圆形，核大，胞浆少，呈集落、贴壁生长，细胞之间边界不清，排列紧密，集落表面光滑、边缘清晰，偶见少许分化细胞。经悬浮培养后，形成的EBs呈球形，边界清楚，细胞排列紧密，表面凸凹不平。EBs贴壁继续诱导分化，在生长因子作用下，从第8d开始可见贴壁的胚胎体逐渐呈扁平状。中心细胞堆积在一起，形态不清。周边开始出现单层上皮样细胞，边界清晰，呈圆形、类圆形或多角形贴壁生长，与体外培养的昆明小鼠正常甲状腺细胞形态相似。至诱导末期，大部分细胞基本分散成上皮样细胞呈单层贴壁生长，中心剩小部分细胞堆积。
2．2 RT-PCR分析结果 诱导培养第0d即ESCs表达ESCs特有基因转录因子Oct4，不表达甲状腺细胞相关基因PAX8、NIS、TSHR、TPO、Tg等；在培养的第6d和第10d均可检测到诱导细胞中有甲状腺细胞基因PAX8、NIS、TSHR、TPO、Tg的表达而无ESCs特有基因Oct4的表达。
2．3 免疫荧光分析 在培养的第8d可检测到分化细胞中甲状腺细胞分化标记物TSHR、TTF-1强表达，PAX8、TTF-2弱表达；第10d所有甲状腺细胞分化标记物均强表达。阳性细胞均位于胚胎体的周边和表层。作为阳性对照的体外培养的昆明小鼠甲状腺细胞也可检测到TSHR、TTF-1、TTF-2、PAX8等标记物的表达。
2．4 双色荧光分析 对TSH等诱导因子阳性的诱导细胞进行双色荧光检测示，甲状腺细胞分化标记物TTF1和PAX8均可见在部分细胞中表达，激光共聚焦两种荧光的融合图像示部分细胞同时表达TTF1和PAX8，双色荧光和细胞的三种图像融合示荧光标记位于细胞核内。TSH等诱导因子阴性的诱导细胞仅可见TTF1的轻度表达，未见PAX8的明显表达。昆明小鼠甲状腺细胞均匀表达TTF1和PAX8,细胞和双色荧光的融合图像示荧光标记位于细胞核内。
2．5 电镜观察 透射电镜下可见诱导细胞形态多样，部分细胞呈老化显像；可见到内分泌类似细胞，微绒毛、高尔基体明显；但未见细胞内存在分泌颗粒。
3 讨论
目前，在研究ES细胞体外分化时，多将ES细胞用悬浮或悬滴培养法培养，使其聚集形成形似早期胚胎的单个聚集体，称为拟胚体（embryonic body，EB）[2]。它不能完全表现胚胎组织结构，但将它消化成单细胞贴壁培养，并在不同的时段添加不同的培养液或细胞因子等，即可促进细胞分化，形成胚外卵黄囊和胚胎的3个胚层[3]。在EB贴壁培养过程中，可直接分析拟胚体中各种分化的细胞的情况，以筛选出适于某一特定细胞分化方向的培养体系和调控因子。起初人们多用来诱导成造血、神经以及心肌细胞，以后又成功诱导出了骨细胞、胰岛细胞等等。但将胚胎干细胞定向诱导分化成甲状腺细胞的研究很少[4]。
理论上，ES细胞可以分化成各种组织细胞，但是现在“定向分化”的条件还不成熟，诱导分化得到的往往都是包含了多种细胞的混合物，目的分化类型细胞所占的比率不高。实验表明，在干细胞诱导过程中，不管哪种诱导因子，它的作用总是有限的，也不可能诱导出唯一的细胞类型，而且在分子水平的诱导机制仍未搞清，这使在诱导ES细胞分化时带有一定的盲目性。由于甲状腺的发生是需要许多细胞因子参与的复杂过程，其中TSH、insulin或类胰岛素生长因子（IGF-1）、KI等是其发育的必需刺激因子，对甲状腺细胞的发育分化、特异基因的表达及功能的产生等起着重要作用[5]，故本实验模拟甲状腺的体内胚胎发生过程逐步加入以上刺激因子对胚胎体进一步诱导，结果随着EB的成族生长，ES也不断生长，而且细胞在形态学上大多属上皮型细胞，与体外培养的正常甲状腺细胞形态一致。进一步用用荧光免疫检测特异性抗体：包括TSHR抗血清、TTF2和Pax8抗体，在用荧光免疫做特异性标记时，发现在第8d，EB外周出现TSHR阳性细胞，接着相继出现了Pax8和TTF2，我们知道有三种因子：TTF-1、TTF-2和Pax8可以在甲状腺形成的早期表达，并调控甲状腺细胞的分化。其中TTF-2是甲状腺特异性基因表达的负向调节因子[6]，并对TTF-1和Pax8的转录起抑制作用[7]。这些因子的出现提示EB已开始向甲状腺细胞分化。
由于本研究仅从形态学和相关分子水平检测到ESCs定向分化过程中含有甲状腺细胞。然而利用ES细胞诱导甲状腺细胞的研究刚刚起步，在应用于临床以前，需要进一步解决的问题很多：如对于怎样进行精密调控，使ES细胞更精确地向甲状腺细胞定向分化，并具有分泌功能；以及避免ES细胞高度未分化，减少形成畸胎瘤的可能等需要更深入的研究。
本文结果表明，利用胚胎干细胞及拟胚体诱导分化成甲状腺细胞的实验中，诱导细胞中含有甲状腺细胞，且可以表达甲状腺特异性因子，这提示胚胎干细胞可以在体外定向分化成甲状腺细胞，而为今后治疗甲状腺功能减退及临床科研工作提供了实验基础，使胚胎干细胞应用于甲状腺疾病成为可能。
【参考文献】
［1］ Klett M. Epidemiology of congenital hypothyroidism. Exp Clin Endocrinol Diabetes，1997，105 Suppl 4：19~23.
［2］ Weiss MJ，Orkin SH.In vitro differentiation of murine embryonic stem cells.New approaches to old problems.J Clin Invest，1996，97：591~595.
［3］ Keller GM.In vitro differentiation of embryonic stem cells.Curr Opin Cell Biol，1995，7：862~869.
［4］ Lin RY，Kubo A，Keller GM，et al.Committing embryonic stem cells to differentiate into thyrocyte-like cells in vitro.Endocrinology，2003，144：2644~2649.
［5］ Deleu S, Pirson I, Coulonval K, et al. IGF-1 or insulin, and the TSH cyclic AMP cascade separately control dog and human thyroid cell growth and DNA synthesis, and complement each other in inducing mitogenesis. Mol Cell Endocrinol, 1999,149:41~51.
［6］ Macchia PE，Mattei MG，Lapi P，et al.Cloning，chromosomal localization and identification of polymorphisms in the human thyroid transcription factor 2 gene（TTF-2）.Biochimie，1999，81：433~440.
［7］ Perrone L，Pasca di Magliano M，Zannini M，et al.The thyroid transcription factor 2（TTF-2）is a promoter-specific DNA-binding independent transcriptional repressor.Biochem Biophys Res Commun，2000，275：203~208.
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